[发明专利]基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域。具体涉及建立油菜子叶为外植体的叶绿体转化组织培养体系，通过基因枪转化法获得油菜叶绿体转基因植株的方法。本发明还涉及到利用油菜叶绿体片段为同源重组片段，构建油菜叶绿体特异性表达载体，对油菜叶绿体进行转化并获得转基因植株的方法。 

背景技术

叶绿体基因工程拥有许多独特的优势，包括基因的高效表达、原核基因无需改造、可实现定点整合、外源基因不会随着花粉扩散等等。而且叶绿体基因工程还克服了传统核基因工程中易出现的基因失活，基因沉默和位置效应等现象，是一种很具有发展前景的植物转基因技术。油菜是世界四大油料作物之一，不仅是食用植物油的最主要来源，也是潜在的仅次于豆粕的大宗饲用蛋白原，还是目前全球用于解决能源危机方向之一的生物柴油的理想原料。 

1988年Boynton等人利用基因枪转化体系，以单细胞生物莱因衣藻为材料，经同源重组，使突变体转化为能进行光合作用的正常莱因衣藻，证实了叶绿体转化是可行的，同时也是首例成功的叶绿体转化报道，标志着叶绿体基因工程的诞生。1989年Pal Maliga等人首次在高等植物烟草中实现了叶绿体转化。自此，叶绿体基因工程迅速发展起来(McBride等，(1995)Amplification of a chimeric Bacillus gene inchloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco.Biotechnology(N Y)13(4)：362-5；Khan MS等，(1999)Fluorescent antibiotic resistance marker for trackingplastid transformation in higher plants.Nat Biotechnol，17(9)：910-5；Hou BK等，(2003)Chloroplast transformation in oilseed rape.Transgenic Res 12(1)：111-4；Kumar等，(2004)Stabletransformation of the cotton plastid genome and maternal inheritance of transgenes.PlantMolecular Biology 56(2)：203-216；Kumar等，Generation of fertile transplastomic soybean.PlantMol Biol 55(4)：479-89；Chakrabarti等，(2006).Expression of the cry9Aa2B.t.gene in tobaccochloroplasts confers resistance to potato tuber moth.Transgenic Res 15(4)：481-8.；Liu，等，(2007).Stable chloroplast transformation in cabbage(Brassica oleracea L.var.capitata L.)by particle bombardment.Plant Cell Rep 26(10)：1733-44；Liu等，(2008).Expression of a Bacillusthuringiensis toxin(cry1Ab)gene in cabbage(Brassica oleracea L.var.capitata L.)chloroplastsconfers high insecticidal efficacy against Plutella xylostella.Theor Appl Genet 117(1)：75-88；Soria-Guerra等，(2009).Expression of a multi-epitope DPT fusion protein in transplastomictobacco plants retains both antigenicity and immunogenicity of all three components of thefunctional oligomer.Planta 229(6)：1293-302.；Scotti等，(2009).High-level expression of theHIV-1Pr55(gag)polyprotein in transgenic tobacco chloroplasts.Planta 229(5)：1109-22。其中，侯丙凯等采用的外植体是油菜萌发4-5天的子叶柄，虽然具有再生率高、再生时间短的特点，但快速进入分化状态对于后续转化植株的同质化是不利的(Hou BK，Zhou YH，Wan LH，Zhang ZL，Shen GF，Chen ZH，Hu ZM(2003)Chloroplast transformation in oilseed rape.Transge Res 12：111-114)。同时，在油菜叶绿体转化中，目前突出的问题就是转化受外植体类型限制、转化频率不高等。本发明从外植体类型 和愈伤组织培养入手，通过较长时期的筛选，通过构建油菜叶绿体特异性表达载体进行转化，建立了一种高效的以油菜子叶为外植体的叶绿体遗传转化方法。