[发明专利]一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法

权利要求书

1.一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法，其特征在于：先通过重组工程将含有同源臂的sacB-neo基因盒整合至大肠杆菌基因组上的靶基因，再将含同源臂的寡核苷酸通过重组工程与基因组上的同源序列进行同源重组而将蔗糖6-果糖转移酶基因和卡那霉素抗性基因去除，从而实现基因敲除和点突变。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，是基因敲除的方法，其中sacB-neo基因盒的同源臂的设计原则是：插入位点两侧各50个碱基，插入位点保留靶基因的读码框。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的用于基因敲除的含同源臂寡核苷酸为84个碱基，前42个碱基和后42个碱基分别与整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒前面的42个碱基和后面的42个碱基相同。

4.如权利要求1所述的，其特征在于，是点突变的方法，其中sacB-neo基因盒的同源臂的设计原则是：插入位点两侧各50个碱基，紧邻插入位点前面的第一个碱基为待突变位点。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的用于点突变的含同源臂寡核苷酸为85个碱基，前42个碱基分别为整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒前面的第2-43个碱基相同，第43个碱基为突变碱基即与紧邻sacB-neo基因盒第一个的碱基不同，点突变的后42个碱基与整合至大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒后面的42个碱基相同。

6.如权利要求1所说的方法，其特征在于，以7.5％蔗糖进行寡核苷酸介导的同源重组突变株的筛选。

7.如权利要求1所说的方法，其特征在于，是使用重组酶表达载体pSC101-BAD-gbaA。