[发明专利]一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种由寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法。

背景技术

大肠杆菌是遗传学、分子生物学、生物化学等研究的重要工具。其典型特征是：生长迅速(倍增时间17分钟)、遗传背景清晰、遗传操作手段多样、多种大肠杆菌的基因组已被解析等等。大肠杆菌也是生产多种活性蛋白、代谢产物(如氨基酸、色素和生物碱)以及次级代谢产物(如生理活性物质)等工业化生产的最重要的菌株之一。鉴于大肠杆菌的重要性，发展快速和简便的对大肠杆菌的基因进行修饰的遗传操作手段非常重要，基因敲除和点突变是其中两个关键的技术。基因敲除的意义在于：大肠杆菌基因组中含有许多对生长或者某特定需要(如表达蛋白或产生特定物质)所不必要甚至不利的基因，将它们去除有利于大肠杆菌的生长以及提高特定目的。点突变的意义在于：一个基因某个或某些位点的改变可能导致期功能的改变或缺失，在基因组上实现点突变将有助于在整体水平上对基因以及其表达的蛋白进行研究。

最初的大肠杆菌基因组修饰是通过大肠杆菌体内重组蛋白RecA所介导的同源重组来实现的。由于大肠杆菌中还存在着能降解线性双链DNA的外切核酸酶RecBCD，因此不能直接转化DNA片段，而必须首先构建环状质粒打靶载体再进行转化。其过程包括：体外用PCR(聚合酶链式反应)、限制酶酶切、连接酶连接等方式将长度为1000个碱基对左右的同源臂装载在质粒载体上，再将筛选标记基因(通常选用抗生素基因)插在两个同源臂中间，最后将打靶载体引入宿主。可见RecA蛋白介导的同源重组反应是一个费时费力的过程。另外RecA系统的重组功能总是处在激活状态，可能会导致一些异常的重组的发生。尽管利用大肠杆菌RecBCD缺陷型菌株可以介导线性打靶载体的体内同源重组，但重组效率十分低。

重组工程的兴起改变了依赖RecA蛋白的历史。重组工程是指由重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因克隆或DNA改造的一种基因工程技术。重组工程在常规基因克隆方法难以进行或效率极低(如待克隆或修饰的DNA片段过大、合适的酶切位点难以寻找、凝胶回收难以进行等等，此时常规基因克隆方法难以进行或效率极低)时有着极大的优势。而且PCR扩增也可能引入错配碱基、DNA片段经紫外线照射等操作也可能基因发生突变。重组工程则避免了这些烦琐操作步骤，可实现高效的基因克隆和修饰，已逐渐成为常规的克隆手段。

重组工程中的重组酶主要是来源自λ噬菌体三个基因，其中exo(redα)编码DNA5′端至3′端的外切酶Exo，其作用于双链DNA分子而产生3′端突出的分子；bet(redβ)编码单链结合蛋白，其结合在由Exo作用而形成的DNA分子的3′突出端，同时还行使重组酶活性，即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火；gam基因编码的Gam蛋白的作用是抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解，这三个基因也就是通常意义上的重组酶基因。recA基因可增加重组的效率。

由于重组工程可以短至36个碱基对的同源区域之间实现同源重组，就使得转化线性双链DNA至大肠杆菌而对其基因进行修饰成为可能。此线性双链DNA而通过一步的PCR手段而一步获得。Datsenko等于2000年首先报道了利用重组工程来实现大肠杆菌基因敲除的研究(Datsenko，K.A.and B.L.Wanner，One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A，2000.97(12)：6640-5)。他们将由PCR获得的、两侧含有同源臂(即与靶基因5′端或3′端序列一致的一段碱基序列)和34个碱基的FRT位点序列的抗性基因电转化至重组酶经诱导表达的大肠杆菌中，通过抗性筛选而直接得到了基因敲除的大肠杆菌突变株。此抗性基因可通过Flp酶催化两个FRT序列之间的同源重组而去除。然而最终所得到的菌株仍然含有一个34个碱基的FRT位点序列。冗余序列的存在可能干扰基因组的总体结构、影响其他基因的表达，如极性效应(及处于相同转录方向的、下游基因的表达收到影响)，也给后续的基因修饰带来困难。