[发明专利]带有绿色荧光蛋白标记的DC-SIGNR体外表达质粒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种带有绿色荧光蛋白标记的DC-SIGNR体外表达质粒及其构建方法。

背景技术

树突状细胞(dendritic cells，DC)在病原微生物的感染和免疫过程中起重要作用，树突状细胞可以捕获病毒并将其呈递给T细胞，诱发T细胞的特意免疫，因而在机体的免疫起始反应中起至关重要的作用。新近的研究发现树突状细胞表面的树突状细胞特异的胞间黏附分子3捕获非整合素(DC-SpecificIntercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin，DC-SIGN)和树突状细胞特异的胞间黏附分子3捕获非整合相关素(DC-SpecificIntercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Related，DC-SIGNR)是很多病原微生物的黏附受体，可以识别结合病原微生物，在感染性疾病的发病和免疫过程中起重要作用。

DC-SIGNR和DC-SIGN是属于C型植物凝集素，同时也是HIV、HCV、CMV，SARS、登革热，埃博拉病毒以及结核杆菌的受体。通过对上述病原微生物的识别和结合，将病原微生物转运到相应的靶细胞，从而完成对靶细胞的感染。

DC-SIGNR和DC-SIGN基因均位于人染色体9p13.2-3。结构研究显示DC-SIGNR和DC-SIGN结构相似，在氨基酸水平有大约70％左右的同源序列。两者结构蛋白均由胞内段、跨膜序列、重复序列区和胞外段的糖基识别域4部分构成，依靠重复序列区本身的结构特点和分子作用力，DC-SIGN/R在细胞表面以二聚体或者四聚体形式存。在DC-SIGN/R的4部分结构中，有两个结构最为重要：一个是末端的糖基识别序列(CRD)，一个是重复序列区。CRD识别、结合配体的糖蛋白，是病原微生物和其它黏附分子结合的基础。DC-SIGN/R的重复序列区通常由数个首尾相连的同序重复顺次连接而成，每个重复序列包含23个氨基酸，由69个核苷酸翻译而来。国外学者通过调查发现DC-SIGN/R的重复序列区多数为7次重复序列，为该基因的野生型，也可出现其它数目的重复序列，表现出重复序列区的多态性。相对而言，DC-SIGN重复序列变异相对较少，多数为6、7、8个重复序列构成，而DC-SIGNR重复序列数目变异较为多见，可以出现3-9个不等的序列变异。

树突状细胞通过DC-SIGN的CRD识别、结合病原微生物表面的糖蛋白，从而和相应的病原微生物结合，借助树突状细胞的黏附游走作用，将病原微生物的从受感染部携带至引流淋巴结或血细胞中，完成对靶细胞的感染。在此过程中，DC可以将病原微生物通过DC-SIGN的黏附作用将病原微生物“富集”在DC表面，大大增强了病原微生物的感染作用。

DC-SIGN在体内主要表达于淋巴结、皮下粘膜组织、肠道和生殖道等处的树突状细胞表面表达。而DC-SIGNR表达更为局限，只是在淋巴结和肝脏窦状内皮较为多见而较少表达于DCs表面，因此DC-SIGNR参与病原微生物感染的具体机制尚不是十分清楚，DC-SIGNR体内的局限表达也使得该蛋白的相关研究产生很大困难。同时，由于DC-SIGNR变异模式更为多见，因而在和病毒作用的过程中，DC-SIGNR相对DC-SIGN作用模式更为复杂。

目前，DC-SIGN的表达调控机制已经明确，在体外通过使用IL-4和PMA对THP-1和PBMC(外周血单个核细胞)行双重刺激下可诱导DC-SIGN在体外表达，为DC-SIGN功能学研究提供了强有力的研究方法和工具。但是DC-SIGNR的表达调控机制目前尚不明确，且国内外尚无DC-DIGNR表达诱导机制的相关研究，因而DC-SIGNR的体外表达模型资料较为缺乏，为DC-SIGNR的功能学研究造成了极大困难。

发明内容

考虑到①DC-SIGNR在很多感染性疾病发病过程中的重要作用；②作为病原微生物的黏附受体，识别、结合的病原微生物谱系更为广泛；③目前尚无DC-SIGNR的体外表达模型，为了解决现有技术所存在的上述问题，本发明提供了一种带有绿色荧光蛋白标记的DC-SIGNR体外表达质粒及其构建方法，通过本发明所构建的质粒经过转染细胞后，可以方便的在多种细胞进行高效表达而无需特别诱导，突破了DC-SIGNR仅仅在体内少数细胞表达的局限及表达调控机制的限制，大大的方便了对DC-SIGNR进行相关研究。

本发明技术方案由以下部分构成：