[发明专利]一对部分同序引物减少其二聚体的方法有效

专利信息
申请号: 201010105371.8 申请日: 2010-02-04
公开(公告)号: CN102146432B 公开(公告)日: 2017-02-15
发明(设计)人: 江洪;张宝林;江必胜;刘涛;张辉 申请(专利权)人: 北京泰格瑞分子检验有限公司
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12Q1/70;G01N21/64;C12R1/93
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 102209 北京市昌平区*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 一对 部分 引物 减少 二聚体 方法
【权利要求书】:

1.“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”,其特征是设计PCR的一对扩增引物最基本原则是尽最大比例的近似单一引物。所述PCR引物对中间区域沿5’-3’方向设置一段4-10BASE同样序列以分散引物链多处间隔互补碱基所形成氢键的合力;所述引物3’末端预留1-5base,其一3’最末端与另一条3’末端最后两个碱基绝对避免互补,也要避免有间隔的碱基互补。所述中间部分同序引物对5’端区域沿5’-3’方向平行比对,不要有3个以上间隔碱基互补,从而优化PCR质量。

2.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”,其设计原则是:首先遵守一般引物设计所有原则,选择一对16~24base长的优化引物对,在其中间位置,都从5’-3’方向设置一段4~10base完全相同的序列,优选设置6~8base完全相同序列;引物对3’末端(即相同序列下游尾端)为1~5个base靶特异性序列,优选2~4base绝不连续互补的靶特异性序列,也尽量避免不连续的单个互补碱基,最多允许一对互补,还不能留在最末端;引物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4~10个base靶特异性序列,优选6~8base绝对没有连续互补的靶特异性序列,尽量选择较少的不连续的单个互补,最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。

3.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”,其特征是中间部分同序的引物对(下面将简称“同序引物对”),进行SYBR Green I实时荧光PCR。同序引物对的浓度也很重要,浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值),过浓引物也将本底的Ct值前移(数字减少),干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应,联合采用各种热启动DNA聚合酶,化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法,将更加极大地完善采用同序引物对的SYBR Green I实时荧光PCR质量。

4.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”,其特征是使用新型SYBR Green ER荧光染料,提高灵敏度10倍以上;也可联合采用巢式nest-PCR,先利用靶外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因,再采用靶内侧短的同序引物对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。

5.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”,其特征采用单一引物,这样就绝对没有引物二聚体的困扰。单管两步法扩增,先进行长时高温退火少量热循环扩增特异性靶基因,产生两端均带少量稀有基因的二次靶模板,再采用单一稀有基因序列引物,常规退火温度退火结合二次模板两侧定量PCR扩增分析。

6.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”,其特征是所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”基因扩增试剂盒,成份包括:样本核酸提取试剂,10mM dNTPs,Taq聚合酶及其缓冲液,荧光染料、荧光探针,引物F/R。

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