[发明专利]一对部分同序引物减少其二聚体的方法

权利要求书

1.“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是设计PCR的一对扩增引物最基本原则是尽最大比例的近似单一引物。所述PCR引物对中间区域沿5’-3’方向设置一段4-10BASE同样序列以分散引物链多处间隔互补碱基所形成氢键的合力；所述引物3’末端预留1-5base，其一3’最末端与另一条3’末端最后两个碱基绝对避免互补，也要避免有间隔的碱基互补。所述中间部分同序引物对5’端区域沿5’-3’方向平行比对，不要有3个以上间隔碱基互补，从而优化PCR质量。

2.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其设计原则是：首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24base长的优化引物对，在其中间位置，都从5’-3’方向设置一段4～10base完全相同的序列，优选设置6～8base完全相同序列；引物对3’末端(即相同序列下游尾端)为1～5个base靶特异性序列，优选2～4base绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能留在最末端；引物对5’端区(即相同序列上游首端区)为4～10个base靶特异性序列，优选6～8base绝对没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。

3.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是中间部分同序的引物对(下面将简称“同序引物对”)，进行SYBR Green I实时荧光PCR。同序引物对的浓度也很重要，浓度不仅影响靶模板扩增效率(Ct读值)，过浓引物也将本底的Ct值前移(数字减少)，干扰低浓度靶模板检测时的正确判断。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg2+缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善采用同序引物对的SYBR Green I实时荧光PCR质量。

4.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是使用新型SYBR Green ER荧光染料，提高灵敏度10倍以上；也可联合采用巢式nest-PCR，先利用靶外侧较长特异性引物(加低浓度)预先小量循环扩增靶基因，再采用靶内侧短的同序引物对常规进行实时荧光定量PCR扩增分析等。

5.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征采用单一引物，这样就绝对没有引物二聚体的困扰。单管两步法扩增，先进行长时高温退火少量热循环扩增特异性靶基因，产生两端均带少量稀有基因的二次靶模板，再采用单一稀有基因序列引物，常规退火温度退火结合二次模板两侧定量PCR扩增分析。

6.根据权利要求1所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是所述的“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”基因扩增试剂盒，成份包括：样本核酸提取试剂，10mM dNTPs，Taq聚合酶及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，引物F/R。