[发明专利]一对部分同序引物减少其二聚体的方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学技术及核酸扩增PCR技术领域，具体涉及一种减少引物二聚体形成的引物设计方法。

背景技术：

核酸研究从确立遗传物质基础为核糖核酸DNA起，历经半个多世纪的探索，到1953年Watson和Crick建立了DNA双螺旋结构模型及阐明了其中心法则，从而开启了核酸研究的分子生物学时代。由于各种核酸DNA都是由四种碱基排列组成的仅编码遗传信息不同的线性结构，其物理化学性能基本一样，难以通过一般理化技术分离纯化微量目的基因或特异性检测微量靶基因。二十世纪70、80年代美国冷泉港(Cold Spring Harber)实验室开发出了完整系统的基于细菌单克隆筛选基因文库及转化基因的分子克隆技术，然而要得到目的基因仍是费时、繁琐的工作。检测靶基因只能通过合成探针经印迹杂交(Dot Blotting)才能检测纳克(ng)级的分子，且定量不准确，操作繁琐。

早在1971年，Korana就提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983年美国PF-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis偶然的产生了核酸扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。

核酸扩增PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：拟扩增的模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：升温至72℃左右，DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～3分钟，2～3小时就能将待扩目的基因呈指数扩增放大百万倍以上。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”--平台期。Mullis经过一系列研究证实了这一技术，申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。