[发明专利]一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法，属于蛋白检测方法技术领域。

背景技术

Birc6(baculoviral Inhibitor of Apoptosis(IAP)repeat-containing 6)被认为是一种抗凋亡蛋白，其基因位于染色体2p22-21。目前birc6的主要检测方法包括蛋白免疫印记法、酶联免疫吸附法，它们的缺点是耗时、费力，灵敏度不够高，不适于大规模样本的筛选。

发明内容

本发明的目的是克服上述问题，提供一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种人血清中肿瘤标记物Bicr6蛋白的质谱筛选方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：采取人全血，4摄氏度下凝固1小时，离心，取上层血清，保存在-80摄氏度冰箱中，将弱阳离子交换磁珠或免疫金属亲和铜离子磁珠与磁珠结合液在薄壁PCR管中混合，加入血清样本，室温孵育5min，将薄壁PCR管置于磁珠分离器内进行磁珠分离，移去上清，将所剩磁珠用磁珠洗涤液洗涤后，加入磁珠洗脱液，将薄壁PCR管置于磁珠分离器内进行磁珠分离，得到洗脱液，将洗脱液与磁珠稳定液混合得到磁珠富集液；

第二步：将第一步得到的磁珠富集液加入基质溶液，按以下条件进行基质辅助激光解离电离飞行时间质谱检测：第一离子源电压：20kv；第二离子源电压：18.6kv；晶体电压：7.6kv；脉冲离子时间：320ns；极性：正；矩阵抑制模式：门控；门控强度：最大；抑制高限：600Da；检测器：1400-1500v；样本率：1.00Gs/s；电子获取：增强，100mv；实时流畅：高；激光频率：20Hz；激光衰减：关73％，范围20％；峰检测标准：信噪比大于5，2Da峰宽过滤，最多峰数200；

第三步：分析第二步得到的质谱图，观察质谱图中质荷比为4964±1处是否有峰，若有峰，则血清中含有Bicr6蛋白。

本发明的优点为：本发明选用快速而敏感的基质辅助激光解离电离飞行时间质谱来检测血清birc6，属于蛋白质组学研究范畴，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在发现和鉴定疾病相关的蛋白或多肽方面是一个非常有效的工具，已经被用来寻找多种疾病特异性标志，该技术联合磁性微粒富集血清蛋白的方法更加快速、有效和精确。这种以磁性微粒为基础的高敏感性和可重复性技术让其在蛋白组学研究领域独树一帜。本方法每次检测只需要数十分钟的时间，完成了血清birc6蛋白的富集和检测，相对于传统的蛋白免疫印记法、酶联免疫吸附法(耗时8小时以上)操作简单、省时，便于大批量样本的检测；因不依赖生物化学反应而不受反应条件的诸多限制，重复性高；另外传统方法的检测灵敏度为微克级，而本方法的检测灵敏度达纳克级，显著高于传统的方法。

附图说明

图1为一份经过磁珠富集后的人血清质谱检测图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例

1.主要试剂

弱阳离子交换磁珠MB-WCX试剂盒(Bruker Daltonik GmbH，德国)，

免疫金属亲和铜离子磁珠MB-IMAC Cu试剂盒(Bruker Daltonik GmbH，德国)

α-氰基-4-羟基肉桂酸α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA)(sigma，美国)

丙酮(sigma，美国)

乙醇(sigma，美国)

AnchorChip^TM靶(Bruker Daltonik GmbH，德国)

2.耗材和仪器

真空采血管(BD Vacutainer^TM，美国)

低温冰箱(SANYO，日本)

涡旋混合仪(H101，上海康禾光电仪器有限公司)

恒温高速离心机(Z400K，HERMLE，德国)

磁珠分离器(Bruker Daltonik GmbH，德国)

Autoflex II基质辅助激光解离离子时间飞行质谱(Bruker Daltonik GmbH，德国)

LC/MS/MS联用仪(美国应用生物系统公司，上海)

其他：注射器、Eppendorf管、加样枪、枪头等

3.生物标本的收集：