[发明专利]一种标记细胞骨架蛋白的多肽及其真核表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及细胞骨架蛋白的标记，特别涉及一种标记细胞骨架蛋白的多肽及真核表达载体。

背景技术

运动是生命体最显著的特征之一。作为生命体组成单位的细胞，其多种多样的生理活动都与细胞的运动密切相关，比如细胞形态的改变与维持、细胞内物质运输、细胞分裂、胞吞与胞吐等。而存在于细胞(特别是真核细胞)中的细胞骨架系统，不仅是支撑活细胞的结构，决定细胞的形状，赋予其强度，而且是细胞内各种细胞器空间排列的物质基础。细胞骨架包括三种类型的蛋白质纤维，即微丝(microfilament)、微管(Microtubule)和中间纤维(intermediate filaments，IF)。

微丝是由肌动蛋白(actin)组成的直径约为7nm的纤维结构。肌动蛋白又被称为G-Actin，全称为球状肌动蛋白(Globular Actin)，简称G肌动蛋白。肌动蛋白单体为球形，其表面上有一ATP结合位点。肌动蛋白单体一个接一个连成一串肌动蛋白链，两串这样的肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝；这种肌动蛋白多聚体又被称为纤维形肌动蛋白(F-Actin，Fibrous Actin)。微丝能被组装和去组装：当单体上结合的是ATP时，就会有较高的相互亲和力，单体趋向于聚合成多聚体，就是组装；而当ATP水解成ADP后，单体亲和力就会下降，多聚体趋向解聚，于是去组装。

细胞内肌动蛋白的这种组装-去组装动态变化参与了细胞许多重要的生理过程，比如细胞运动时伪足的生成、发育时期干细胞的迁移、神经元细胞生长锥的生长、细胞与细胞外基质的相互作用以及肿瘤细胞的转移等。

鬼笔环肽(phalloidin)是从毒蕈类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)中得到的有毒的环状七肽，它同细胞松弛素B的作用相反，只与聚合的微丝(F-Actin)结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后，抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。

鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合的特殊性质使得它具有一个重要的用途：通过让这种毒素与荧光物质结合，然后FITC和Rhodamin等荧光物质标记的鬼笔环肽再特异的与真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布，研究细胞内部的工作机制。生产这种荧光标记的鬼笔环肽的公司包括Invitrogen和Sigma公司，但是售价不菲。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种相对廉价的、实时的标记细胞骨架蛋白F-actin的多肽及真核表达载体，该多肽转入细胞或者通过真核表达载体在细胞得到表达后可以与微丝结合，结合荧光标记的多肽能够用于细胞骨架蛋白的标记。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种标记细胞骨架蛋白的多肽，该多肽为JN27，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的多肽是在JN27的C端增加3个氨基酸残基得到的多肽JN30，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的多肽是在JN27的N端增加11个氨基酸残基的穿膜肽得到的多肽TatJN27，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

一种用于细胞骨架蛋白标记的真核表达载体，该载体包含标记基因EGFP和细胞骨架蛋白靶向基因的融合基因，所述的细胞骨架蛋白靶向基因为基因JN27或JN30；基因JN27的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，基因JN30的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

所述的真核表达载体是pEGFP-C2-JN27，通过HindIII和BamHI酶切位点将基因JN27克隆到pEGFP-C2载体上。

所述的真核表达载体是pEGFP-C2-JN30，通过HindIII和BamHI酶切位点将基因JN30克隆到pEGFP-C2载体上。

多肽JN27、JN30或TatJN27应用于细胞骨架蛋白的标记。

所述的应用于细胞骨架蛋白的标记是将多肽JN27或JN30用荧光物质标记后，再将荧光标记的JN27或JN30加入到抗体封闭液中，与经过固定、Triton处理的待标记细胞孵育2h，然后在荧光显微镜下显示标记结果；

或者将多肽TatJN27用荧光物质标记后，再将荧光标记的TatJN27直接加入待标记细胞的培养液中，37℃孵育12h；然后在荧光显微镜下显示标记结果。

真核表达载体pEGFP-C2-JN27或pEGFP-C2-JN30应用于细胞骨架蛋白的标记。