[发明专利]一种病原微生物分析检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微全分析技术在生物分析领域的应用，尤其涉及一种基于微流控芯片技术的病原微生物分析检测方法。

背景技术

强致病性病原微生物往往致病力强，如肠出血性大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)的最低感染剂量可少于10个病原菌。因此，发展对环境、食品和临床标本中病原微生物的快速、灵敏、特异的分析检测方法是人类社会预防传染性疾病扩散，确保人类健康的迫切需要。目前，常规的病原微生物检测方法主要有培养法、免疫学检测法和分子生物学法，且都因其自身研究手段的局限性而存在许多不足：传统的细菌培养法和生化鉴定法特异性低、耗时费力、对培养环境和操作人员要求严格，不适宜病原菌的快速检测。免疫学检测方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物发光免疫分析法、免疫胶体金技术等一般需要提供数量较多的纯化细菌，或需对样品进行浓缩富集，同样难以在短时间内获得检测结果。PCR及其相关技术虽具有高度的特异性和灵敏度，但由于方法过度敏感，在检测过程中，因为样本污染、RNA非法转录、靶RNA低水平表达、引物设计不合理以及实验条件未优化、取材的局限等常常出现假阳性或假阴性结果。

相对于现有检测技术的缺陷，20世纪90年代初期出现的微流控芯片技术以其高度的集成化、微型化、分析手段的多样化、分析速度快、准确度高等特点，在技术上呈现出独特的优势，适合病原微生物快速检测的多项要求：首先，微流控芯片系统具有多种操作单元灵活组合、整体可控和规模集成的特点，可将整个病原微生物的样品处理和检测分析过程整合在一块芯片上；第二，通过MEMS加工，可以很容易的在芯片上刻蚀密集的分析通道阵列，大大增加了分析通量，并且芯片每一通道之间均相互独立，避免了样本的交叉干扰，分离分析过程完全在一个相对密闭的通道中进行，降低了操作者被感染的危险性。第三，鉴于芯片微通道的结构(微升级或纳升级)，微尺度下的高比表面积，流体传质、传热快，有效地降低了样品和试剂的消耗量，大大缩短整个分析时间，达到快速分析的目的。因此，利用微流控芯片技术进行微生物研究越来越受到人们的重视。

目前，经过十多年的发展，各种基于微流控技术开展的病原微生物预处理(Inami H，et al.Biosens Bioelectron.2009，24(11)：3299-3305；KulinskiMD，et al.Biomed Microdevices.2009，11(3)：671-678.)、富集/分选(Bao N，et al.J Chromatogr A，2008，1181(1-2)：153-158；Qiu J，et al.Talanta.2009，79(3)：787-795.)以及分离检测(Lee SJ，et al.Sensors and ActuatorsB，2008，132(2)：443 448；Zordan MD，et al.Cytometry A.2009，75(2)：155-162.)的新方法不断涌现。但现有的技术和方法主要是针对病原微生物分析检测中的某一单元或步骤，如富集/分选、预处理或分离检测展开的，即通常检测需要分几次完成，有大量的操作误差积累，且存在分析时间过长和样品损失大，有检测误差大、时间长、检测时消耗的药品和试剂量大等缺点。

因此，在同一微流控芯片上实现病原微生物的分选/富集、内涵物裂解、生物发光反应和检测一步完成的检测方法，是目前亟待即将的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种病原微生物分析检测方法，简化现有技术中病原微生物的分析检测过程，降低样品用量和试剂耗量，避免多个分析步骤或过程导致的操作繁琐、分析时间过长和样品损失，提高检测准确度和灵敏度。

本发明所述的病原微生物分析检测方法主要包含步骤：

1)取用于病原微生物检测的微流控芯片进行检测，所述微流控芯片包括盖片和基片，盖片和基片封接贴合，盖片上设置有两条流体传输通道、六边形免疫识别/富集腔、生物发光检测单元和两个储液池，免疫识别/富集腔的两端分别与第一、第二流体传输通道连通，第一储液池与第一流体传输通道连接、第二储液池与第二流体传输通道连接，第一、二储液池分别位于芯片的两端，储液池与外部传输装置相连，生物发光检测单元位于第二流体传输通道的末端或第二储液池，第二流体传输通道与免疫富集腔间为“台阶”状；

2)将经抗体修饰的免疫微珠装填于步骤1)所述的微流控芯片中的免疫识别/富集腔中；