[发明专利]从厌氧发酵系统获取生物质转化相关基因的方法

权利要求书

1.一种从厌氧微生物群落筛选生物质转化相关基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)从厌氧微生物群落提取元基因组DNA，收集DNA片段，连接入载体中，包装、转染入宿主细胞，获得携带所述DNA片段的细胞克隆；

(2)从步骤(1)获得的细胞克隆中筛选具有生物质转化性状的细胞克隆，所述克隆中携带生物质转化相关基因；和

(3)鉴定或分离步骤(2)获得的具有生物质转化性状的克隆中生物质转化相关基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的厌氧微生物群落选自：含有纤维素物质的工农业生产废弃物或畜牧养殖产生的家畜粪便经过产氢、产甲烷或堆肥产生的微生物群落。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的载体选自：Fosmid载体或者Cosmid载体；或

收集的DNA片段的长度是30-55kb。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提取元基因组DNA时，包括：

(a)裂解微生物细胞：用蛋白酶K和SDS处理微生物细胞，在55±2℃孵育15-40分钟，接着在70±2℃孵育8-12分钟，获得裂解液，去除裂解液中的细胞碎片和杂质，获得上清；和

(b)从上清提取DNA。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，去除裂解液中细胞碎片和杂质的方法是：将裂解液于17000±2000g下离心8-12分钟。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，首先采用苯酚、氯仿、异戊醇抽提上清；接着采用氯仿、异戊醇抽提上清；接着用异丙醇在5400±500g下离心沉淀DNA。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物质转化相关基因选白：内切葡聚糖酶基因，内切木聚糖酶基因，β-葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因；或

所述的生物质转化性状选自：

对应于内切葡聚糖酶：水解培养基中的羧甲基纤维素钠，刚果红染色呈现黄色水解圈；

对应于内切木聚糖酶：水解培养基中的木聚糖，经刚果红染色呈现黄色水解圈；

对应于β-葡萄糖苷酶：水解培养基中的七叶苷，与柠檬酸铁铵形成黑色沉淀，呈现黑色水解圈；

对应于外切葡聚糖酶：水解培养基上的4-甲基伞形酮-β-D-纤维二糖，在紫外光激发下呈现荧光水解圈。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括：对生物质转化相关基因进行测序，测序的方法包括：

(i)选取2-100个具有生物质转化性状的细胞克隆分别进行培养，将获得的细胞培养物混合，获得混合的细胞体系；和

(ii)从所述混合的细胞体系中提取DNA，测序。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，分别进行培养时，将细胞克隆培养到基本上相同的细胞数，再将各细胞培养物混合。

10.一种从厌氧微生物群落提取DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a1)裂解微生物细胞：用蛋白酶K和SDS处理微生物细胞，在55±2℃孵育15-40分钟，接着在70±2℃孵育8-12分钟，获得裂解液，去除裂解液中的细胞碎片和杂质，获得上清；和

(b1)从上清提取DNA。