[发明专利]从厌氧发酵系统获取生物质转化相关基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和微生物领域，更具体地，本发明涉及一种从厌氧发酵系统获取生物质转化相关基因的方法。

背景技术

在厌氧发酵系统的生物质转化过程中，主要存在着四个阶段：第一阶段为水解阶段，发酵原料中以木质纤维素为主的大分子有机物被水解为各自的单体物质；第二阶段为酸化阶段，单体物质再进一步降解为挥发性脂肪酸；第三阶段为产乙酸阶段，第四阶段为产甲烷阶段。这四个不同的阶段需要不同微生物类群的参与，这些微生物类群分别具有与其功能相对应的从纤维素分解到甲烷产生过程中关键酶的基因，包括与木质纤维素水解、产氢产酸及甲烷形成相关的基因资源。这些基因和酶在生物能源、食品、造纸、饲料、纺织、发酵、环境和医药等多个领域具有广泛的应用价值，将成为一种丰富的尚待挖掘的基因资源。

获得环境微生物的酶或其功能基因的传统方法，首先需要从环境中分离纯化目标微生物。但是，由于目前自然界中大部分的微生物的分离培养条件尚不清楚，分离培养纯菌既耗时而且有多数情况下并不能获得目标微生物。所以，对大多数环境微生物而言，尽管知道它们的存在，也了解它们的部分生理功能，但却无法获得它们的纯培养物，特别是厌氧发酵体系中，有90％以上的微生物不仅没有纯培养物，而且对它们的系统进化或分类地位也缺少相应的信息。对这些未培养微生物酶资源或基因资源的挖掘，已经无法采用传统的依赖于纯培养的微生物学技术。

近几年发展起来的元基因组学(metagenomics)技术，绕开分离培养，通过直接从环境中抽提微生物核酸并构建元基因组文库(BAC，Fosmid、Cosmid或者质粒文库)，通过功能筛选或同源序列筛选，获得具有某种表型或序列的阳性克隆，经过对阳性克隆的序列分析，获得功能基因或基因簇，从而有可能获得大量的新基因。但是，如何选择适当的环境微生物系统来满足不同目的功能基因的筛选，如何高效率地从复杂体系中分离提纯DNA，如何建立高通量的筛选体系以及对阳性克隆的低成本、高效的序列分析方法，仍是利用元基因组技术开发新基因资源需要解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从厌氧微生物群落筛选生物质转化相关基因的方法。

在本发明的第一方面，提供一种从厌氧微生物群落筛选生物质转化相关基因的方法，所述方法包括：

(1)从厌氧微生物群落提取元基因组DNA，收集DNA片段，连接入载体中，包装、转染入细胞，获得携带所述DNA片段的细胞克隆；

(2)从步骤(1)获得的细胞克隆中筛选具有生物质转化性状的细胞克隆，所述克隆中携带生物质转化相关基因；和

(3)鉴定或分离步骤(2)获得的具有生物质转化性状的克隆中生物质转化相关基因。

在一个优选例中，所述的厌氧微生物群落选自：含有纤维素物质的工农业生产废弃物(如秸秆、玉米芯等)或畜牧养殖产生的家畜粪便经过产氢、产甲烷或堆肥产生的微生物群落。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的载体选自：Fosmid载体或者Cosmid载体；或

在另一优选例中，步骤(1)中，收集的DNA片段的长度是30-55kb(较佳地36-48kb)。

在另一优选例中，提取元基因组DNA时，包括：

(a)裂解微生物细胞：用蛋白酶K和SDS处理微生物细胞，在55±2℃孵育15-40分钟，接着在70±2℃孵育8-12分钟，获得裂解液，去除裂解液中的细胞碎片和杂质，获得上清；和

(b)从上清提取DNA。

在另一优选例中，蛋白酶K的终浓度是1±0.2mg/ml；SDS的终浓度是1±0.2mg/ml。

在另一优选例中，步骤(a)中，在55±1℃孵育18-22分钟，接着在70±1℃孵育9-11分钟。

在另一优选例中，步骤(a)中，去除裂解液中细胞碎片和杂质的方法是：将裂解液于17000±2000g(优选17000±1000g；更优选17000g)下离心8-12分钟(优选10分钟)。

在另一优选例中，步骤(b)中，首先采用苯酚、氯仿、异戊醇(优选按照体积比25∶24∶1)抽提上清；接着采用氯仿、异戊醇(优选按照体积比24∶1)抽提上清；接着用异丙醇(优选0.6倍体积)在5400±500g下离心沉淀DNA。

在另一优选例中，在裂解微生物细胞前，还包括：采用差速离心法去除厌氧微生物群落中的粗颗粒或非细胞物质。

在另一优选例中，所述的生物质转化相关基因选自(但不限于)：内切葡聚糖酶基因，内切木聚糖酶基因，β-葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因；或