[发明专利]一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品过敏源甲壳类基因的快速检测技术，适合于食品过敏源甲壳类基因成分的定性检测。

背景技术

食品过敏是食品引起的机体对免疫系统的异常反应，多因人体对某些外来食品成分的反应过火或对某些蛋白质以及某些食品成分缺乏消化能力所致。常见的食品过敏与免疫球蛋白E有关；而致敏物即为某些蛋白。食品过敏目前还没有很好的治疗手段。常见的易过敏食品有：甲壳类、花生、树坚果、鸡蛋、牛奶、小麦制品、豆制品等，其中甲壳类海鲜食品是最严重的过敏源之一。

近年来针对聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术在甲壳类基因检测方面得到的应用，是目前甲壳类食品过敏源基因检测的主要方法，目前国内外市场上已经有了关于甲壳类食品过敏源基因检测试剂盒，但是其检测都需要数目较多且价格昂贵的一系列仪器，尤其不适合于现场快速检测与基层单位的广泛应用；且容易造成假阳性等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、灵敏、快速地检测食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法，适合于现场快速检测。

本发明提供一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒，包括如下部分：

a)DNA裂解液：

pH8.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，含有质量浓度为1％的chelex树脂；

b)恒温扩增反应液：

包含正向外围引物、反向外围引物、两条探针、一条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的正向外围引物序列为5’-GATTAAGTTACTTTAG-3’；

所述的反向外围引物序列为5’-GATTTAAAGGTCGAACAG-3’；

所述的两条探针的序列分别为：5’-TTCAACATCGAGGTCGC-3’和5’-TGTCGATATGAACTCTC-3’，其中一条探针的5’端标记生物素(Biotin)，另外一条探针5’端标记FitC(FitC)；

所述的交叉引物为：5’-TTCAACATCGAGGTCGCTTTAGGGATAACAGCGT-3’；

所述的1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

所述恒温扩增检测试剂盒，还包含阳性对照模板，该阳性对照模板为含有甲壳类食品过敏源16S rRNA基因片段的质粒。

本发明还提供用所述恒温扩增检测试剂盒检测食品过敏原甲壳类基因的方法，包括下列步骤：

a)用DNA裂解液从待检测的标本中提取DNA；

b)将步骤a)提取的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在58℃下扩增反应80分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板，其中，阳性对照模板为含有甲壳类食品过敏源16S rRNA基因，所述阴性对照模板为无菌双蒸水；

c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置(申请号：200610109620.4)中进行检测，15min以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有甲壳类食品过敏源核酸。

本试剂盒的工作原理：

在本发明提供本试剂盒中，有两条外围引物，一条交叉引物引物和两条检测探针。本试剂盒中的5条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我循环。

步骤b)的扩增反应中包含两个阶段：

第1阶段为起始阶段，任何一条引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。交叉引物可与本身置换出来的单链形成互补结构，形成发夹状结构的单链，该结构为基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段，以发夹状结构为模板，两条探针可以与发夹状结构中的环结合，开始链置换合成反应，解离出的由探针扩增出来的单链可以重新解链成为扩增的模板。同时两条探针可以形成一个双链杂交复合物。

当扩增出目的序列时，由于该目的序列上同时标记了Biotin和FitC，因此试纸条的检测线上呈阳性。