[发明专利]蛹虫草退化菌种快速鉴定方法

说明书

技术领域：

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法。

背景技术：

蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link)又称为北虫草，属于子囊菌门Ascomycota、子 囊菌纲Ascomycetes、肉座菌目Hyocreales、麦角菌科Clavicipitaceae、虫草属Cordyceps。蛹 虫草广布世界各地，我国各省都有分布。

与蛹虫草同属的冬虫夏草(C.sinensis(Berk.)Sacc.)是传统的中药资源，具有保健和 药用价值，特别是抗肿瘤的功效。蛹虫草的药理和毒理等方面研究已表明，蛹虫草的营养成 分和药用价值与冬虫夏草相似，可作为冬虫夏草的代用品(徐锦堂，1997)。由于近年来冬虫 夏草的资源短缺、价格昂贵，蛹虫草渐受到消费者的青睐，市场需求旺盛。在自然资源难以 满足需求的情况下，蛹虫草的人工栽培是解决这一需求的最佳选择。

目前，蛹虫草批量生产中的核心技术难题是菌种的严重退化。菌种经传代2～3次后，生 产性能会明显变化。经分离得到的优良菌种，一般使用半年也会发生退化。菌种退化是不可 逆而且可遗传的，因此给蛹虫草的批量生产带来极大的风险(Li et al.1994；Horgen et al.1996； Ryan et al.2003)。解决蛹虫草的菌种退化问题已成为国内外学者研究的焦点。

菌种退化是菌类栽培中普遍存在的现象。退化食用菌的表型为子实体原基减少，产孢能 力大幅度上升或下降，培养周期变长，甚至子实体生长受阻(丁湖广，2006)。为解决蛹虫草 的退化问题，公告号为CN1094091的专利公开通过常规单孢或多孢分离方法，蛹虫草原始菌 株经过母种、原种、栽培种的三次筛选，获得优良菌种；公告号为CN1710063的专利公开通 过将子实体内部组织接种到高效PDA培养基上培养获得候选菌株，然后栽培试验，鉴别菌种 生产性能以筛选出优良菌种；公告号为CN101353628的专利公开通过挑选草牙金黄色、长势 健壮、菌丝整齐、菌落淡黄色的菌株作为可育的优良菌株。上述现有技术都是通过后期的大 量栽培试验而获得优良菌种，因此周期较长，速度较慢，且要花费很多原料。

至今，针对菌种退化问题，主要尝试过以下解决方法：(1)优化培养基，改进栽培条件； (2)尽量减少转代次数；(3)菌种复壮。但这些措施未能从根本上解决菌种的退化问题。 菌种退化可能涉及一系列极其复杂的生理、生化和遗传过程。退化菌株与正常菌株相比，其 生理生化过程、分子水平和遗传性状都可能表现出极大差异。

发明内容：

本发明的目的是提供了一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法。

本发明是根据蛹虫草的正常菌种和退化菌种两者对合成染料脱色能力的差异，将指示剂 溴麝香草酚蓝添加到培养基，利用颜色变化或/和脱色率区分退化菌种与正常菌种，从而实现 了本发明的目的。

本发明的蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，包括以下步骤：

a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养，然后将获得的一级菌 种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养，得到蛹虫草二级液体菌种，经过滤 获得蛹虫草的孢子液；

b)将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中，使每毫升色度培养基中含有孢子1×10³～1 ×10⁶个，然后在常规培养条件下振荡培养；

c)8-15天后，取出孢子培养液，观察孢子培养液的颜色，当孢子培养液的颜色为蓝色或 者绿色时，判断该蛹虫草菌种为退化菌种。

所述的色度培养基的组分如下：按质量分数100％计，酵母粉0.45％、细菌蛋白胨 0.75％、乳糖0.5％、溴麝香草酚蓝(BTB)0.025‰、余量为水。

本发明还提供了另一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，包括以下步骤：

a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养，然后将获得的一级菌 种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养，得到蛹虫草二级液体菌种，经过滤 获得蛹虫草的孢子液；