[发明专利]海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域：

本发明涉及分子生态学领域，尤其是一种操作方法简单，在一般实验室即可快速、方便地得到大片段微生物基因组总DNA样品的海水养殖池塘中底泥微生物基因组DNA的提取方法。

背景技术：

底泥微生物是养殖池塘生态系统中的重要组成部分，直接影响池塘中养殖动物尤其是底栖生活习性动物的生长，其组成结构可为指导健康养殖及衡量养殖环境优劣提供科学依据。然而，由于底泥微生物中仅有1％的可培养菌，因此必需获得高质量、多样性程度高、具有代表性的底泥微生物DNA，才能分析出养殖环境的菌群组成结构。目前，在对自然生境中的土壤、污泥中的微生物多样性研究中，已尝试采用溶菌酶、超声波法及玻璃珠等DNA提取方法，并在提取过程中应用PVPP、CTAB等去除腐植酸、粘粒等严重影响后续分子操作的物质。然而，因海水养殖池塘地处潮间带的特殊环境，加之有饵料碎屑、养殖动物粪便等沉积，使底泥的组成比自然生境的土壤、污泥更为复杂，迄今为止，还没有关于海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA提取方法的相关报道。

发明内容：

本发明的目的是为了提供一种操作方法简单，在一般实验室即可快速、方便地得到大片段微生物基因组总DNA样品的海水养殖池塘中底泥微生物基因组DNA的提取方法。

本发明的技术解决方案是：

一种海水养殖池塘底泥微生物基因组DNA的提取方法，依次按照如下步骤进行：

a.取0.3～0.5g底泥样品于离心管中，加入800～1000μl预处理缓冲液，涡旋混匀；所述预处理缓冲液为100μl pH 5.5的1M Tris-HCl buffer、700μl超纯水以及200μl 0.2M Al₂(SO4)₃的混合溶液；

b.用4M NaOH调a步骤所得溶液的pH至8，3500g×2min离心弃上清，取沉淀；

c.向所得沉淀中加入300～400μl浓度为5mg/ml的溶菌酶涡旋混匀，再加入100～120μl浓度为10％的SDS、15～25ul 25mg/ml蛋白酶K，涡旋混匀；

d.加入200～400μl 5M NaCl涡旋混匀，加入180～280μl 65℃预热的CTAB-NaCl，涡旋混匀，65℃作用20min后11,000g×1min离心取上清；

e.在上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，涡旋混匀，11,000g×15min离心取上清，酚/氯仿/异戊醇的体积比为25∶24∶1；

f.加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋混匀，氯仿/异戊醇的体积比为24∶1，11,000g×15min离心取上清；

g.重复步骤f一次；

h.将上清移至1.5ml离心管，加入0.7倍体积异丙醇、0.1倍体积5MNaCl，室温过夜，18,000g×30min离心弃上清，向沉淀中加入1ml预冷70％乙醇重悬、洗涤；

i.18,000g×30min离心后弃除上清，干燥沉淀，加入30～50μl 1×TE，4℃溶解至少4h。

本发明可在一般实验室快速、方便地得到大片段的池塘底泥微生物群落的总DNA样品，获得的底泥基因组DNA纯度大于1.6(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，片断大于20Kb，适合作为DGGE(变性梯度凝胶电泳)指纹分析池塘底泥微生物种群结构与多样性的16S rDNA-PCR扩增的高质量模板，同时也适合作为基因文库构建的样品DNA，为指导海水池塘健康养殖及衡量养殖环境优劣提供科学依据。

附图说明：

图1为本发明实施例1、2所提取的海水养殖池塘底泥微生物总DNA模板的琼脂糖凝胶图。

图2为以本发明实施例1、2所提取的海水养殖池塘底泥微生物总DNA为模板16S rDNA-PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测图。

图3为以本发明实施例1、2所提取的海水养殖池塘底泥微生物总DNA为模板16S rDNA-PCR扩增产物的DGGE图谱。

具体实施方式：

实施例1：

a.使用灭菌药匙刮除大连黑石礁养殖池塘表面底泥后，采集深2～3cm处底泥约20g放入灭菌广口玻璃瓶，使用灭菌药匙于无菌操作台内充分搅拌、混合底泥，取0.3g样品于离心管中，加入800μl预处理缓冲液，涡旋混匀3min，预处理缓冲液为100μl pH 5.5的1M Tris-HCl buffer、700μl超纯水以及200μl 0.2MAl₂(SO4)₃的混合溶液；