[发明专利]小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括有标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备、有效性验证及结果检测判定，其特征在于，所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中

正向引物的序列为：5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，

反向引物的序列为：5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；

所述荧光探针的序列为：5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’。

2.如权利要求1所述的小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线的步骤为：

(1)模板的制备：

将构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.94×10⁹拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；

(2)实时荧光定量PCR反应体系：

25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循环反应：

根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，C_T值为y轴的标准曲线。

3.如权利要求1所述的小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述有效性验证及结果检测判定的步骤为：

(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；未感染MHV小鼠的cDNA，1μl；

利用感染MHV小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；感染MHV小鼠的cDNA，1μl；

(2)循环反应：

按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(3)有效性验证：

荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应无C_T值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其C_T值应＜32，否则重做。