[发明专利]小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒检测方法，具体的地说是一种小鼠肝炎病毒(MHV)实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)可引起小鼠发生肝炎、脑炎和肠炎，一般呈亚临床感染或慢性感染，而机体抵抗力低时可引起急性发病死亡，导致实验失败。MHV可改变各种免疫应答参数，影响酶的活性，从而对实验产生严重的干扰。

目前，检测各种病毒的方法很多，如血清学实验、组织块培养和共培技术、核酸杂交和常规PCR检测技术等，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染，也比较容易出现假阳性结果，并且实验时间也相对较长。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效方法。实时荧光定量PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法的检测灵敏度可达到1.0×10⁴个拷贝的病毒分子，对于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。

按照本发明提供的技术方案，所述小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法包括步骤如下：

1、标准质粒的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得小鼠肝炎病毒的保守基因，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分子；

2、特异性引物及荧光探针的设计：以步骤1中选取的高度保守序列为基准，设计一对特异性引物及一条荧光探针；设计原则为：每条引物的长度为18-25个碱基，荧光探针长度为20-30个碱基；特异性引物和荧光探针中GC含量要求在40-60％，理论Tm＞50℃；特异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的3’端避免碱基配对；选用的特异性引物和荧光探针要设计在小鼠肝炎病毒基因中的保守区，只对小鼠肝炎病毒特异，和其他物种无交叉反应；荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域；

所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中

正向引物的序列为：5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’；

反向引物的序列为：5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；

所述荧光探针的序列为：5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’；

3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，包括步骤：

(1)模板的制备：

将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.94×10⁹拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的稀释液，稀释液在-20℃条件下保存备用；

(2)实时荧光定量PCR反应体系：

25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR buffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物(PrimerF)，2.5μl；300nM反向引物(PrimerR)，2.5μl；模板，1μl；

(3)循环反应：

根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；

(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，C_T值为y轴的标准曲线；