[发明专利]磁响应性极高吸附容量溶菌酶分子印迹纳米粒子制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和新材料领域，涉及溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备，具体涉及具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，此纳米粒子既具有对溶菌酶的特异性吸附，又具有超顺磁性，可实现外界磁性作用下的快速分离，避免了传统的复杂前处理程序。

背景技术

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。目前，溶菌酶已成为当前各领域关注的热点。在医学领域，胃组织中溶菌酶的表达与胃癌的预后有十分密切的关系，血清中的溶菌酶与黑色素肿瘤免疫、白血病分型有关；在生物医药领域，溶菌酶可用于抗菌消炎、增强免疫剂；在食品安全领域，溶菌酶是一种抗菌保鲜的食品添加剂；因此，开展溶菌酶的提纯和检测具有十分重要的现实意义。

分子印迹技术，就是以目标分子为模板分子，将结构上具有互补的功能化聚合物单体通过共价或非共价键与模板分子结合，并加入交联剂进行聚合反应，反应完成后通过物理或化学方法将模板分子洗脱出来，形成的一种具有固定空穴大小和形状及有确定排列功能团的交联高聚物。此类聚合物既保持了高聚物操作较简单，产率高，物理和化学稳定性强，保存方便的优良特性，又具有生物抗体特有的亲和力和选择性，已成为当前目标物提纯和净化的首先方法。此外，磁性材料的引入可以赋予仿生人工抗体以磁性，实现在保持其特异性识别和专一性吸附特性的同时实现快速的磁分离，为分子印迹纳米粒子的应用提供一个广阔的发展空间。

目前，小分子的印记技术已趋于完善，而大生物大分子诸如蛋白、基因、细胞等的分子印记技术处于起步阶段，依然面临极大的挑战。最大的难题是由于生物蛋白分子庞大，构建的吸附位点较少，蛋白印迹的选择性不高。本发明拟利用纳米粒子比表面积大的特性，将分子印迹薄膜紧密生长其上，并利用多种作用力构建出对溶菌酶特异性吸附的三维孔穴结构，提高分子印迹聚合物的吸附容量，为大分子印记技术的发展提供一种思路，不仅具有较高的学术价值，也具有很好的经济和社会价值。

发明内容

本发明的任务是提供一种具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，使其具有制备简单、成本低廉，制备出的溶菌酶分子印迹纳米粒子集特异性吸附强、物理和化学稳定性高、可实现快速磁分离和反复回收利用等特点。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理，防止磁性纳米粒子相互聚集；

步骤二：在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiO₂薄膜；以提供活性基团(-OH)和防止Fe₃O₄磁性纳米粒子的氧化；

步骤三：对表面包被有二氧化硅SiO₂薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯基和丙烯酰氧基修饰；磁性纳米粒子需要在其表面进行功能化修饰，以保证分子印迹膜的紧密生长；

步骤四：在包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子表面生成溶菌酶分子印迹聚合物薄膜。

上述步骤(一)所述的所述的采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理的方法是：将磁性纳米粒子分散到0.7～1mol/L的表面活性剂溶液中，所述的表面活性剂为柠檬酸钠或油酸，使磁性纳米粒子的最终浓度为0.01g/mL～0.1g/mL，40～60℃条件下，反应12～24小时后，采用纯水洗涤以去除表面活性剂，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度达到1g/mL。本发明实施例使用的磁性纳米粒子是Fe₃O₄磁性纳米粒子，购于南京工业大学纳米应用研究中心，磁性粒子的粒径为10-20nm，且具有超顺磁性。