[发明专利]牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛分枝杆菌检测方法，具体地说，涉及一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法。

背景技术

自从1882年Kock发现结核分枝杆菌以来，分枝杆菌新菌种的发现、命名、分类及其演变都有很大的发展变化。在微生物分类学上，分枝杆菌归属于原核生物界、原壁菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌属成员均为好氧，平直或弯曲细长，革兰氏阳性杆菌。在一定情况下可产生菌丝，但这些菌丝在搅动后成为杆状或球形。

1898年，Smith首次将牛分枝杆菌(M.bovis)和其它的分枝杆菌明确区分开来。牛分枝杆菌主要感染不同种属的温血动物，包括有蹄动物、有袋动物、食肉类动物、灵长类、鳍脚类动物和啮齿类动物在内的50多种哺乳动物，还包括类鹦鹉鸟、石鸽、北美洲乌鸦等20多种禽类，其中牛是最敏感的动物。

在核苷酸水平上，牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组相比，其同源性大于99.95％，表现出共线性，没有广泛的置换、复制或倒置现象。在牛分枝杆菌基因组全序列测定之前，一般是利用基于杂交原理(高度准确的序列鉴定)方法来比较结核分枝杆菌复合群之间的基因差别，发现牛分枝杆菌基因组中存在大小为1～12.7kb不等的片段缺失。在牛分枝杆菌中，仅有一个被称作TbD1的基因位点，在现有的大多数结核分枝杆菌中没有该基因的存在。因此，基因缺失在牛分枝杆菌基因组形成中可能起到了至关重要的作用。

实时荧光定量PCR(real-time fluorogenetic quantitative PCR)是在定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。这种探针的长度为20-24bp，在其5’末端标记一个荧光报告基团，3’末端标记一个荧光淬灭基团，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。该法利用Taq酶的5’-3’外切酶活性，当探针保持完整时，淬灭基团吸收发射基团的发射荧光。在PCR的退火期，探针与模板发生特异性杂交，延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当达到探针后，TaqMan的外切酶活性将探针切断，荧光信号得以释放。模板每复制一次，就有一次荧光信号的释放，通过该技术可以对模板进行准确定量。

荧光定量PCR采用密封系统，将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化，在单一反应管中进行，自动化程度高，可避免在PCR期间及PCR之后产物受到污染，确保结果的准确性。荧光定量PCR在扩增过程中实时监控，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，计算每个样品Ct值。由于Ct值与起始模板浓度的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，根据标准曲线获得定量结果。Mishra等用巣式PCR对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌进行区分和检测，但是巣式PCR比荧光PCR步骤繁琐，而且及其不敏感。

研究发现，500bp基因片段为牛结核杆菌基因组所特有的基因，利用这个片段可以用于牛结核分枝杆菌的诊断和鉴别，但应用500bp基因片断进行的PCR检测并不能检出所有的牛分枝杆菌，存在漏检现象。Taylor等人对牛分枝杆菌基因数目可变区RD4侧翼序列设计引物，用SYBR Green荧光定量PCR方法进行检测，并和传统PCR方法比较，结果显示特异性提高，表明该序列可以对牛分枝杆菌进行特异性检测。但是很多研究都没有进行绝对定量，本发明根据229bp对牛分枝杆菌的高度特异性，建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供牛分枝杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，利用Taqman荧光定量PCR检测方法的快速、敏感和特异性，准确检测并鉴定牛分支杆菌引起的牛结核病。