[发明专利]一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法。

(二)背景技术

根结线虫主要包括南方根结线虫(Meloidogyne incognite)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)四种，根结线虫是葫芦科、茄科、豆科作物的一种毁灭性虫害。根结线虫的危害主要表现在形成根结，造成根系发育受阻和腐烂，植株地上部衰弱和枯死；同时，根结线虫的危害又加重了枯萎病、根腐病等土传性真菌病害和部分细菌病害的发生。根据联合国粮农组织的估计，每年线虫给蔬菜作物造成的损失超过产量的20％。为了研究根结线虫的防控以及接种鉴定根结线虫，需要繁殖分离根结线虫。目前对根结线虫的繁殖通常利用烟草、番茄等植物的实生苗作为宿主，在适宜的季节或者利用温室、人工气候室进行，这是一项繁杂、费时、费力的工作，受到季节和试验条件的限制(刘维志，《植物病原线虫学》，中国农业出版社，2000年，第414～428页；冯志新，《植物线虫学》，中国农业出版，2001年，第68～203页。)

另一方面，发根农杆菌侵染植物形成转基因不定根，不定根具有快速生长繁殖的特性；不定根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；不定根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性；不定根在适宜条件下可以再生出完整植株；不定根可以作为生物活性物质的发生器(Guillon S，Tremouillaux-Guiller J，Pati P K，Rideau M，Gantet P.Hairy root research：recent scenario and exciting prospects.Curr Opin Plant Biol，2006，9(3)：341-346.Georgiev M I，Pavlov A I，Bley T.Hairy root type plant in vitrosystems as sources of bioactive substances.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74(6)：1175-1185.)。

目前还未有利用转基因不定根繁殖根结线虫的报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法，实现对根结线虫了快速、简便、大量、均一的繁殖。

一种利用转基因不定根繁殖根结线虫的方法，所述方法包括：

(1)用发根农杆菌K599侵染带有伤口的黄瓜子叶，侵染后的黄瓜子叶于含乙酰丁香酮25mg/L的MS培养基中共培养2～3天后，用含头孢霉素500mg/L的MS培养基清洗，再转入含卡那霉素50mg/L+头孢霉素500mg/L的MS培养基中进行诱导培养，诱导出的不定根经除菌和繁殖，获得转基因不定根于不含任何植物激素和抗生素的MS培养基中繁殖保存；

(2)挑取根结线虫的卵囊，经消毒后接种至培养于MS培养基中的转基因不定根上，于20～25℃下进行培养30～50天，在形成的根结中获得根结线虫。

具体的，所述步骤(2)方法如下：番茄苗接种根结线虫，常规条件培养40～50天后，挑取根上的根结线虫卵囊，用0.1％升汞消毒5min，无菌水清洗后，接种至转基因不定根进行培养。培养条件为：温度20～25℃，湿度75％以上，12h/8h光照黑暗交替，光强1200～2400Lux。

所述发根农杆菌K599可为野生型发根农杆菌K599，为便于检测，也可为带有标记基因的重组发根农杆菌K599，所述重组发根农杆菌K599可含有本领域常规用作植物转基因表达载体的质粒，具体可为下列之一：(1)pBIN-35S-GFP、(2)pBI121、(3)pCAMBIAL300、(4)pCHS、(5)pKH200等。

作为优选的技术方案，所述发根农杆菌K599可选用含有质粒pBIN-35S-GFP的重组发根农杆菌K599。

所述质粒pBIN-35S-GFP为含CaMV 35S启动子驱动和gfp基因(GenBank登记号：U17997)的植物转基因表达载体，可参照《含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达》(徐纪明，向太和，2008年)中的方法进行构建，具体构建过程见图1。