[发明专利]一种节杆菌突变株、利用该突变株生产乳糖酶的方法及用乳糖酶制备乳果糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体地，涉及一种节杆菌突变株、对其发酵培养生产乳糖酶的方法及用该乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法。

背景技术

乳果糖(Lactulose，4-O-β-D-galactopy-ranosyl-D-fructose)，又名乳酮糖，是由半乳糖和果糖以β-1，4-糖苷键结合的二糖。1930年，Montgomery首次发现乳果糖，其后，乳果糖的结构和生理功能研究进展迅速。到目前为止，确定乳果糖主要的生理功用有：(1)促进双歧杆菌增殖，调整肠道菌群平衡；(2)治疗肝性脑病，降低内毒素；(3)导泻作用，用于慢性便秘；(4)用于监视肠壁的通透性；(5)预防结肠息肉术后复发；(6)增强机体免疫作用；(7)影响营养物质代谢；(8)影响胆汁酸循环和内分泌。

目前，乳果糖的制备主要是利用乳糖在碱性介质中异构化，生成乳果糖的化学方法。但是采用碱性试剂为催化剂时，乳糖会降解生成半乳糖及己糖酸，并伴有颜色副产物产生，降低了乳果糖收率，造成产物分离困难。为此，国内外研究人员将乳果糖生产的研究重点集中于不同催化剂的使用和分离方法的开发，例如US 4,957,564与JP 01-193281采用铝酸钠催化体系，并采用硫酸调节pH生成氢氧化铝沉淀，通过去除沉淀进而除去铝离子。CN1093410采用加热溶解乳糖，然后保持沸腾，滴加碱溶液，反应结束后调节pH至4-4.5，脱色，采用阴、阳离子交换树脂脱盐，然后真 空浓缩、冷却结晶可制得乳果糖浆。但是，产物得率低、工序复杂，成本高仍是化学法乳果糖制备中有待解决的问题。

与之相比，酶法乳果糖制备可以避免产物降解和有色副产物生成等问题，目前国内外的研究尚处在起步阶段。因此，开发可以进行酶法转化制备乳果糖的乳糖酶及其微生物生产菌种具有一定的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种可发酵生产乳糖酶的微生物-节杆菌突变株，及利用该突变株生产乳糖酶的方法。

本发明的另一个目的是利用上述乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，克服化学法乳果糖制备中产物易降解以及有色副产物难以去除的缺陷。

实现上述目的的技术方案如下：

一种节杆菌突变株，该菌株分类命名为Arthrobacter sp.jnsb-2，目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，登记入册的编号是CCTCC M 209210，保藏日期是：2009年9月27日。

该菌株具有下述性质：

1、形态特征：

菌株在乳糖酵母膏蛋白胨固体培养基上生长良好，菌落为淡黄色，电子显微镜下显示细胞为杆状，两端钝圆。

2、生理生化特性：

(1)培养温度：在20-37℃。最适温度为30℃。

(2)明胶液化淀粉水解：阳性。

(3)革蓝氏：阳性。

(4)乳糖发酵：阳性。

(5)H₂S生成：阴性。

3、16S rDNA序列分析：长度1383bp，序列与GenBank中的节杆菌属16S rDNA 具有较高的同源性，其中与Arthrobacter sp.CDB1、Arthrobacter sp.AGL 5、Arthrobacter sp.2-12的相似性为99％。

上述节杆菌突变株可应用于发酵生产乳糖酶，利用其发酵生产乳糖酶的方法为：

将菌株经固体斜面活化、种子培养后再进行发酵培养，其中发酵培养的培养基：碳源可选用葡萄糖、乳糖、淀粉、麦芽糖或甘油中的任一种，其质量体积比浓度为0.2％-2％；氮源可选用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕或玉米浆中的一种或多种，其质量体积比浓度为0.5-2.5％；无机盐可选用硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或氯化铁中的一种或多种，其浓度为0.05-23mmol/L；发酵培养的条件为：20-37℃培养12-30h；后将生成的发酵液经5000rpm-8000rpm离心得到菌体，随后经破碎细胞、10000-12000rpm离心取上清液即为酶液。

进一步地，所述发酵培养基的碳源、氮源、无机盐分别优选乳糖、玉米浆、氯化铁。

利用上述乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为：

(1)底物溶液的配制

用pH5.5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖的质量体积比浓度为2-40％，果糖的质量体积比浓度为1％-20％；

(2)水解和转苷反应