[发明专利]表达可溶性FGF-21的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种表达可溶性FGF-21的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌包括携带重组质粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21的大肠杆菌DH5α，以及同时携带重组质粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21和质粒pTf16-P_araB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)；其中，所述重组质粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21中的P_T7lac是质粒pET32a(+)的启动子，TrxA是硫氧还蛋白，6×His是组氨酸纯化标签；所述质粒pTf16-P_araB-tig中的P_araB是质粒pTf16的启动子。

2.如权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

第一步FGF-21 DNA序列的扩增

以含有FGF-21 DNA序列，即SEQ ID NO.1序列的重组质粒作为模板；

设计引物，引物为：

F1：5’GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3’，即SEQ ID NO.2序列；

F2：5’ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3’，即SEQ ID NO.3序列；

通过PCR扩增获得FGF-21 DNA序列，同时在该序列两端引入酶切位点Bgl II和EcoR I；

第二步构建含FGF-21 DNA序列的基因工程菌

用限制性内切酶Bgl II和EcoR I分别双酶切所述第一步获得的FGF-21 DNA片段和质粒pET32a(+)，分别纯化回收大片段，并将其连接，得到含FGF-21 DNA片段的重组质粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21；

将所述重组质粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21转化到大肠杆菌DH5α，构建含FGF-21 DNA序列的基因工程菌；

第三步构建可溶性表达FGF-21的基因工程菌

将质粒pTf16-P_araB-tig和重组质粒pET32a(+)-P_T7lac-TrxA-6×His-FGF-21分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达可溶性FGF-21的基因工程菌。

3.一种用权利要求1所述的基因工程菌生产FGF-21的方法，其特征在于，步骤如下：

第一步液体培养

将所述表达可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液体培养基中培养；然后，将培养所得菌液按比例转接入乳糖自诱导培养基中培养；最后离心收集菌体；

第二步纯化制备FGF-21融合蛋白

将第一步中收集的菌体用IDA-0缓冲液重悬，超声破碎后，离心收集上清，进行镍离子亲和层析，收集FGF-21融合蛋白；其中，所述IDA-0缓冲液的组成包括：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M NaCl；

第三步制备FGF-21

用肠激酶酶解以上所得的FGF-21融合蛋白，经裂解后，再次进行镍离子亲和层析，收集含FGF-21的组分，并用超滤管将其脱盐和浓缩，得到产物FGF-21。

4.如权利要求3所述的生产FGF-21的方法，其特征在于，所述乳糖自诱导培养基的配方包括：胰蛋白胨0.25-4％，酵母提取物0.125-2％，NaCl 0.125-2％，Na₂HPO₄ 12.5-200mM，KH₂PO₄ 12.5-200mM，(NH₄)₂SO₄ 6.25-100mM，MgSO₄ 0.5-8mM，甘油0.125-2％，葡萄糖0.0125-0.2％，乳糖0.05-0.8％。

5.根据权利要求1所述基因工程菌表达的FGF-21，在制备治疗糖尿病的药物中作该药物活性成分的应用。