[发明专利]表达可溶性FGF-21的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域中的基因工程菌及其构建方法和应用，特别是涉及表达可溶性人成纤维生长因子21，即FGF-21的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

糖尿病是严重威胁人类健康的三大疾病之一，发病率呈逐年上升趋势。预计到2025年，全球糖尿病的发病率将接近成年人的7％。糖尿病不仅仅是心血管疾病的危险因素，还导致全球每30秒就有1人需要截肢，它也是引起肾衰竭和失明的首要原因。据统计，每年约有350万人死于糖尿病。美国每年治疗2型糖尿病总共需花费1320亿美元，因此开发高效低价的糖尿病新药具有广阔的市场前景。

根据美国糖尿病协会估算，美国糖尿病患者中，90％以上是2型糖尿病患者。2型糖尿病是一种包括胰岛素分泌减少、外周组织胰岛素抵抗、进行性β细胞功能不全、血糖控制进行性恶化以及大血管和微血管并发症危险性增加等在内的多因子疾病，它的发病是以餐后高血糖和空腹高血糖为特征的。对大部分人而言，高血糖的产生是由于胰腺β细胞分泌的胰岛素不足以补偿外周组织中的胰岛素抵抗。

目前，胰岛素是被广泛使用的降糖药，但用胰岛素治疗2型糖尿病可能会产生低血糖、体重增加、过敏、浮肿等副作用，因此在临床上存在一定的用药风险。

FGF-21是最近发现的FGF基因家族中的一位新成员。相关研究表明FGF-21是一非常有意义的保护糖代谢稳态的细胞因子，具有胰岛素类似的作用，能抑制胰高血糖素的分泌，促进脂肪组织对葡萄糖的吸收，增加胰岛素的敏感性，因此FGF-21可以作为今后一种新的降糖药物。

FGF-21的生物学功能主要有几方面：

(1)降低血糖和类胰岛素作用，能调节糖代谢。主要可能是通过上调GLUT-1的表达促进脂肪组织对葡萄糖的摄取、抑制胰高血糖素的分泌、增加胰岛素敏感性、保护胰腺β细胞、促进胰岛素合成、调节血液循环中脂肪细胞因子等功能来降低血糖。但与胰岛素不同的是，其降血糖作用起效慢、作用强、持续时间长，它不会引起胰岛素受体酪氨酸磷酸化。任何剂量的FGF-21均未引起低血糖的发生以及体重的增加。这些说明FGF-21是非胰岛素依赖性的，它与胰岛素共同作用具有叠加效应。

(2)调节脂代谢，降低甘油三酯的水平，改善脂代谢的紊乱。血浆甘油三酯(TG)降低幅度呈剂量依赖性，而且能持续较长时间。

(3)抵抗饮食诱导肥胖的发生，能通过减轻体重来改善胰岛素抵抗，是代谢综合征的独立相关因素。

(4)FGF-21是FGF基因家族中的一员，但相关研究并没有发现肝脏肿瘤的发生以及其他任何组织的增生，说明FGF-21不会促进有丝分裂，从而为今后FGF-21用于糖尿病治疗的安全性提供了依据。

综上所述，FGF-21有明显的优势，可开发为新型治疗2型糖尿病新型的降糖药物。

但是，根据国内外的研究情况，由于大肠杆菌自身在表达外源目的蛋白的限制，FGF-21在大肠杆菌中主要是以包涵体形式表达，难以获得高效稳定的可溶性表达。国外对FGF-21的研究还不多，Kharitonenkov等人最早以pET30a为载体，在大肠杆菌中表达FGF-21，但是FGF-21仅以包涵体形式存在。(A.Kharitonenkov，T.L.Shiyanova，A.Koester，et al.FGF-21 as anovel metabolic regulator. The Journal of clinical investigation，2005，115：1627-1635.)。在其他FGF-21相关研究中，研究人员也多采用Kharitonenkov等人的方法来表达纯化FGF-21。

虽然分子伴侣作为一种能够介导蛋白质进行正确折叠的蛋白质，它能使蛋白质获得正确的构型，增强其可溶性。但是，本发明所采用的方法，即在同一菌体内，使用含有分子伴侣基因的质粒，通过诱导表达分子伴侣蛋白，进而促进FGF-21的可溶性表达，在目前国内外FGF-21研究中尚未见有报道。