[发明专利]麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法

权利要求书

1.一种麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法是将制备的Curcin粗提液先进行脱盐及缓冲液交换并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分，然后将收集的组分进行阴离子交换层析并收集上样后穿透组分，再后将收集的穿透组分用缓冲液进行稀释，最后将稀释后的组分溶液进行阳离子交换层析，并收集最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品。

2.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中脱盐及缓冲液交换步骤是先用缓冲液A进行柱平衡，然后将Curcin粗提液作为样品上样，并收集上样后第一个280nm吸收峰的组分，其中缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，填料采用Sephadex G 25superfine填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。

3.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中阴离子交换层析步骤是先用缓冲液A进行柱平衡，然后将脱盐及缓冲液交换步骤收集的组分作为样品上样，上样后收集穿透组分，其中缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，填料采用QSepharose FF填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。

4.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中稀释步骤用缓冲液B对阴离子交换层析步骤收集的组分进行稀释，稀释倍数10-30倍，其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液。

5.根据权利要求1所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法中阳离子交换层析步骤采用具有二元泵混合系统的液相色谱仪，其中A泵输送缓冲液B，B泵输送缓冲液C，且A、B两泵的液体能以任意比例混合，层析时，先用A泵输送缓冲液B进行柱平衡，然后将稀释步骤稀释后的组分溶液作为样品上样，上样后先用A泵输送缓冲液B冲洗2-4个柱体积，再用A、B两泵同时输送缓冲液B、C并依次进行阶段洗脱和线性梯度洗脱，阶段洗脱的长度为4-6个柱体积，线性梯度洗脱的长度为18-22个柱体积，并收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰的组分，该组分即为最终的Curcin纯品，其中缓冲液B为柠檬酸三钠缓冲液，缓冲液C为柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液，填料采用SP Sepharose HP填料，流速为100-200cm/h，检测器波长选择280nm。

6.根据权利要求2或3所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法使用的缓冲液A，即Tris-HCl缓冲液中Tris的浓度为20-50mM，pH 8.0-8.5。

7.根据权利要求4或5所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法使用的 缓冲液B，即柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸三钠的浓度为20-50mM，pH 4.8-5.2。

8.根据权利要求5所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法使用的缓冲液C，即柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液是在缓冲液B中加入0.9-1.1M的氯化钠经搅拌溶解均匀而成，pH 4.8-5.2。

9.根据权利要求5或8所述的麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法，该方法在阶段洗脱时B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量为9-11％，在线性梯度洗脱时，B泵输送的缓冲液C在混合液体中的体积百分含量由起始点以线性方式逐渐增加至结束点。其中起始点的体积百分含量为9-11％，结束点的体积百分含量为38-42％。