[发明专利]麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物天然蛋白质的分离纯化技术领域，具体涉及一种麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法。 

背景技术

麻疯树属于大戟科(Euphorbiaceae)油料植物，广泛分布于我国西南地区，是我国重要的资源植物。麻疯树种子含油量高达40％，是理想的生物柴油生产原料，具有良好的应用前景。同时，麻疯树种仁中蛋白质含量也相当丰富。近年已有文献报道，从麻疯树种仁中分离得到了一种毒蛋白，被命名为Curcin。经实验证明，Curcin属于I型核糖体失活蛋白(林娟等，“麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究”，高技术通讯，2002，11，36-40，现有技术1)。核糖体失活蛋白是一类细胞毒素蛋白，如将其与单克隆抗体结合，制成免疫毒素(immunotoxic)，可大大提高其作用的专一性，有望开发成专一杀伤癌细胞的药物，在癌症治疗方面具有很大的发展潜能(Lin JY，Tserng KY，Chen CC，Lin LT，Tung TC.Abrin and ricin：new anti-tumour substances.Nature1970；227：292-293.)。 

随着Curcin的成功分离，对于Curcin的抗肿瘤、抗真菌活性研究也相继展开。抗肿瘤活性的研究显示，Curcin对胃癌细胞系SGC-7901、骨髓瘤细胞系Sp2/0、人肝癌细胞系(human hepatoma)等三株细胞的蛋白合成有较强的抑制作用(Lin Juan et al，“Antitumor effects of curcin from seeds of Jatropha curcas”，Acta Pharmacologica Sinica，2003，24(3)，241-246)。抗真菌活性的体外研究显示，Curcin对水稻稻瘟病菌、松赤枯病菌、玉米纹枯病菌、油菜菌核病菌等四种农作物病原菌有明显的抑制作用(魏琴等，“麻疯树毒蛋白(Curcin)的抗真菌活性研究”，中国油料作物学报，2004，26(3)，71-75)。这些研究显示，Curcin作为I型核糖体失活蛋白，在癌症治疗、作物育种、农药开发等方面具有很大的开发潜能及广阔的应用前景。因此，Curcin的提取及分离纯化也就显得十分的重要了。 

目前，麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法已有报道(林娟等，“麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究”，高技术通讯，2002，11，36-40)。该方法 披露的分离纯化过程简单叙述如下： 

将麻疯树种仁加入磷酸缓冲液中浸泡，之后在植物匀浆机上匀浆。4℃下搅拌后离心取上层清液，用60％、95％两个饱和度依次进行硫酸铵沉淀，收集第二次硫酸铵沉淀的沉淀组分，重新溶解于少量磷酸缓冲液，得到Curcin粗提液。粗提液经过透析，最后进行凝胶过滤分离，得到Curcin纯品。 

但综合分析上述Curcin分离纯化方法，尚存在以下一些不足： 

第一，由于该方法仅采用了凝胶过滤一种层析方法对Curcin粗提液进行蛋白纯化，因而使得终产品Curcin中还含有相当数量的杂蛋白(见图5中的1号泳道)，其纯度尚不能很好的满足基于Curcin的各种毒理、药理等基础研究。 

第二，由于该方法使用的凝胶过滤层析流速慢，工艺耗时较长，因而不利于Curcin活性的保持。 

第三，根据该方法的描述，其工艺耗时约58小时(透析耗时48小时，凝胶过滤耗时10小时)，因而工艺周期较长，不利于生产成本的控制及终产物活性的保持。 

第四，由于该方法采用的凝胶过滤是穿透性层析，要得到理想的分离效果，上样量须小于柱体积的5％。如果工艺需要放大，则不可避免的造成样品体积增大，要维持原有分离效果，就需要大幅增加柱体积以满足上样量的增加。但凝胶过滤填料十分昂贵，柱体积的增加必然造成成本的大幅上升。同时，由于柱体积大幅上升，层析柱也需同步更换为更粗或更长的层析柱，因而势必带来生产成本的大幅上升，所以该方法的可放大性不够。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种终产物活性和纯度高，纯化工艺周期短，工艺可放大性好的麻疯树种仁毒蛋白Curcin的分离纯化方法，以便为更深入研究开发Curcin在癌症治疗、作物育种、农药开发等方面的应用价值创造必要的条件。