[发明专利]基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法

权利要求书

1.一种基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步、从革兰氏阳性安全微生物宿主中分离与透明质酸前体，即UDP-葡萄糖醛酸以及UDP-N-乙酰-葡萄糖氨的合成相关的基因，包括：UDP-葡萄糖脱氢酶基因，即SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34；UTP-葡萄糖-1-磷酸转移酶基因，即SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37；葡萄糖-6-磷酸变位酶基因，即SEQ ID No.38、SEQ ID No.39；葡萄糖-6-磷酸异构酶基因，即SEQ ID No.40；氨基转移酶，即SEQ ID No.41以及N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因，即SEQ ID No.42和SEQ ID No.43；

第二步、按照步骤一所述的革兰氏阳性安全微生物宿主的密码子偏好性对SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48进行碱基替换，分别得到SEQ IDNo.1到SEQ ID No.27共27种不同的序列；

第三步、将来自SEQ ID No.1到SEQ ID No.27中的任一种基因以及SEQ ID No.31到SEQ IDNo.43基因的一种以上的基因与组成型启动子或者可诱导启动子组成一个基因表达盒；

第四步、采用电转化的方法、制备原生质体的方法或制备感受态细胞的方法将基因表达盒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，用选择标记筛选，得到能分泌透明质酸的革兰氏阳性基因工程安全宿主菌；

第五步、对革兰氏阳性基因工程安全宿主菌进行发酵培养，在培养阶段加入诱导透明质酸合成的诱导剂以提高透明质酸的合成水平，发酵结束后即从培养基中分离纯化得到基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸；

所述的透明质酸由D-葡萄糖醛酸与N-乙酰基葡萄糖氨以双糖单元交替连接而成的直链大分子酸性粘多糖，其分子量为五万到五百万道尔顿。

2.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征是，所述的革兰氏阳性安全微生物宿主是指以下菌中的任一种：丁酸梭菌或酪酸梭菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、有益或无毒蜡样芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌或嗜淀粉拟杆菌。

3.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征是，所述的含有SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48基因的微生物依次分别为：兽疫链球菌、类马疫链球菌、绿草履虫小球藻病毒1、化脓链球菌以及乳房链球菌。

4.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征是，所述的进行碱基替换是指：按照宿主基因组的密码子偏好性进行密码子优化，将来自其它非宿主菌的与透明质酸合成相关的基因按照宿主菌的基因在翻译成蛋白质时所采用的密码子偏好性进行碱基替换。

5.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征是，所述的基因表达盒中包括组成型启动子或化学诱导启动子，其中：

组成型启动子是指：宿主菌在培养的任何时期均具有转录活性的启动子；所述的可诱导启动子是指：在宿主菌培养的特定时期才具有转录活性的启动子，具体包括：化学诱导启动子和物理诱导启动子。

6.根据权利要求5所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征是，所述的化学诱导启动子包括：巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的启动子、巨大芽孢杆菌的木糖异构酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌的木糖异构酶基因的启动子、大肠杆菌的阿拉伯糖利用操纵子的启动子、大肠杆菌的乳糖利用操纵子的启动子、大肠杆菌。