[发明专利]基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid，以下简称HA)为一种线性不分支高分子多糖，以UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)以及UDP-N-乙酰葡萄糖氨(UDP-N-GlcNAc)两种前体经透明质酸合成酶(HA synthases，HAS)催化合成，其平均分子量可高达到数百万道尔顿。它作为一种多功能基质，广泛分布于人体组织器官，以其独特的分子结构和理化性质在机体的正常生理活动中发挥非常重要的作用，如润滑关节、维持皮肤良好的弹性、调节血管壁的通透性、刺激调节免疫系统、调节蛋白质以及水电解质扩散及运转与促进创伤愈合等，其与机体的生理与病理的关系非常密切。HA已经广泛用于制备关节疾病治疗的药物(Mazieres，et al 2007)、药物输送载体(Fuente，et al 2008；Bechara，et al 2008)、皮肤填充剂(Romagnoli，et al 2008；Tezel and Fredrickson，2008)以及药物交联剂(Leonelli，et al 2008)等医药领域方面。

目前有两种HA的生产方法，一种是从鸡冠等动物组织里提取，另一种是采用链球菌C群中的一些减毒菌株(兽疫链球菌或马疫链球菌等)进行发酵，从发酵液中提取。从鸡冠中提取的HA虽然早已批准用于上述医药领域，然而，从中提取的HA结合有大量的糖蛋白以及糖脂，使得其分离纯化非常困难，得率非常低(每百克鸡冠仅能提取0.4克的纯品)。而且，鸡冠来源的透明质酸易受到种间病毒因子以及其它致病因子的污染。由于从动物组织中提取HA的以上不足，人们逐渐把目光转向微生物发酵来制备HA。目前研究最多的就是采用兽疫链球菌或类马疫链球菌来发酵生产HA。但由于上述链球菌属于条件致病菌，对生产人员的健康以及环境存在潜在的危害，越来越多的研究表明该类链球菌亦能产生一定量的内毒素(endotoxin)以及其它毒性因子(virulence factors)(Leonard，et al 1998；Steiner and Malke，2002；Hashikawa，et al 2004；Lindsay，et al 2009)，使得从发酵液中提取的HA存在包括内毒素在内的毒性因子污染的可能性。目前医药领域使用的HA仍然采用从鸡冠等组织中提取，其提取工艺复杂与原料的来源非常有限使产品价格非常昂贵。因此研究一种提取方法简单、原料易得、生产安全以及无毒素因子的新型的透明质酸的制备方法显得非常必要。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN1636052A，公开日2005-7-6，记载了一种“在重组宿主细胞中产生透明质酸的方法”，中国专利文献号CN101426925A，公开日2009-5-6，记载了一种“在芽孢杆菌细胞中生产透明质酸的方法”，以及美国专利文献号US2002/0160489，公开日2002-10-31，记载了一种“Streptococcus equisimilis hyaluronan synthase gene andexpression thereof in Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌的streptococcus equisimilis透明质酸合成酶基因和其表达式)”，该技术利用枯草芽孢杆菌作为宿主，将来源于Streptococcusequisimilis透明质酸合成酶基因及其调控序列整合到枯草芽孢杆菌宿主基因组中并实现透明质酸的合成。

上述现有技术的共性在于描述了采用枯草芽孢杆菌作为宿主，将合成透明质酸的相关基因与组成型淀粉酶基因的启动子构成一个人工操纵子，所有的基因均利用该组成型淀粉酶基因的启动子来启动转录，透明质酸的合成与宿主细胞的增殖是同步进行。上述技术虽然能够实现透明质酸在枯草芽孢杆菌中的异源合成，但是存在显而易见的问题是：随着透明质酸的合成，发酵培养基的粘度也逐渐上升，溶氧量也迅速下降，细胞获取氧的能力也迅速下降，细胞的生物量也增加缓慢或停止增加，由此而导致细胞合成透明质酸的能力迅速下降。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，通过将宿主细胞的生长与透明质酸的合成分开进行大大提高了宿主细胞合成透明质酸的能力，不但实现透明质酸在安全的革兰氏阳性微生物中的合成，而且其合成即可以是组成型的，也可以是被诱导的。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：