[发明专利]吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用

权利要求书

1.一种吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物，其结构通式如式1所示：

式中：

R₁为H、Cl、F、CH₃、OCH₃、OH或NO₂；

R₂为2-苯基-2H-1，2，3-三唑-4-取代基或喹喔啉-2-取代基。

2.一种权利要求1所述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的合成方法，包括以下步骤：

(1)、去甲去氢斑蝥素的合成：将顺丁烯二酸酐研细，加入乙醚，室温条件下搅拌至溶解，滴入呋喃，室温搅拌24～48小时，呋喃与顺丁烯二酸酐发生Diels-Alder反应，制得去甲去氢斑蝥素；

(2)、N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的合成：将去甲去氢斑蝥素溶于丙酮溶剂中，在搅拌下滴加苯胺的丙酮溶液，反应1小时后加入醋酸锰、三乙胺和醋酐，升温溶解；在50-60℃下反应3～8小时；滤去不溶物，将滤液冷冻，倒入冰水混合物中，析出固体，过滤，滤饼用冰水洗涤，甲醇重结晶，真空干燥；

(3)、在N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的的C₅和C₆双键上，应用氯胺T的简易方法进行1，3[3+2]偶极环加成，引入五元杂环吡唑环结构，得到吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺衍生物。

3.一种权利要求1所述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的活性测试方法，包括以下步骤：

(1)、将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心，用新培养基悬浮重新后用液体分装仪mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞；

(2)、将步骤1的A549细胞在37℃、5％CO₂条件下培养24h后，用自动化液体处理系统Bravo分装药物进行刺激，各种化合物的处理浓度有；16uM 8uM 4uM 2uM 1uM 0.5uM 0.25uM 0.125uM，每种处理有四个重复；

(3)、将步骤2的A549细胞培养48h后，用CCK-8试剂盒对细胞的活性进行检测：每孔加入5ul CCK-8溶液，用酶标仪读取各孔波长在450nm处的吸收值；在细胞培养箱内继续孵育100min，用酶标仪再次读取波长在450nm处的吸收值，取两次吸收值的变化值除以未加化合物处理孔的吸收值变化，取每组四个重复的平均值即为孔内细胞活性。化合物对细胞的抑制效率＝1-孔内细胞活性，将根据化合物浓度与细胞活性的梯度输入至http://bsmdb.tmd.ac.jp:3000/cbdb/ic50，计算最终得到IC50。

4.一种权利要求1～2所述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物在合成抗肿瘤药物上的应用。