[发明专利]吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用

说明书

技术领域：

本发明属于斑蝥素衍生物领域，更具体是涉及一种新型的吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物及其合成方法、活性测试方法与应用。

背景技术：

斑蝥素(cantharidin)是我国民间中药，是治疗恶性肿瘤药物的有效成份。现代研究证明，其对原发性肝癌有一定疗效，而且有升高白细胞，不抑制免疫系统等优点，因此，具有很高的药用研究价值，引起人们的广泛关注。但斑蝥素的毒性较大，合成很复杂，近来研究表明，去甲斑蝥素(norcantharidin)中少了2，3位的两个甲基，去甲斑蝥素不仅保持了较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用，而且毒性大大降低，基本上消除了斑蝥素对泌尿系统毒刺激副作用。

因此，与斑蝥素骨架修饰有关的一项具有重大意义的合成工作是去掉2，3位甲基取代。这一结构改变不会影响抗癌活性而毒性有所降低，并且，使得合成步骤简化。另一方面，斑蝥素衍生物的活性研究进展情况表明，斑蝥素的构效关系如下：1)双环[2.2.1]庚烷是斑蝥素的基本骨架环，除去2-C或3-C上的甲基不会影响其活性；1-C或4-C上引入取代基会使其活性降低，在1-C位具有绝对立体构型的斑蝥素衍生物对PP2B具有良好的抑制选择性；5-C或6-C上可以引入取代基，在5-C或6-C上引入取代基会相反地影响对PP1和PP2A的相互作用，同时加强对PP2B的抑制。5-C和6-C之间也可以是双键；7-氧桥键是必不可缺的，可能是氧原子能和PP1和PP2A形成氢键的缘故；2)酸酐环上酸酐部分还原则会失去对PP1和PP2A的抑制作用。

对斑蝥素结构5-C或6-C的改造工作一般都只是引入取代基，但药理测试结果不够理想。

发明内容：

本申请人经研究发现，吡唑类杂环衍生物也具有强烈的生理和药理活性，如抗菌，抗痉挛消炎调节植物生长和抗血小板凝聚等作用，在医药和农药的生产中有重要用途。正是在这启示之下，鉴于不同活性杂环在同一分子中聚集能明显改善或增强化合物的生物活性这一特征，以及生物电子等排原理，申请人设计合成在去甲斑蝥素取代芳胺结构中5-C和6-C双键上进行1，3[3+2]偶极环加成引入五元杂环吡唑环，得到一系列含N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的吡唑衍生物。

由此，本发明的主要目的在于提供一种新型的吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物。

本发明采取的技术方案如下，一种吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物，其结构通式如式1所示：

式1

式中：

R₁为H、Cl、F、CH₃、OCH₃、OH或NO₂；

R₂为2-苯基-2H-1，2，3-三唑-4-取代基或喹喔啉-2-取代基。

本发明的次要目的是提供一种上述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的合成方法，包括以下步骤：

(1)、去甲去氢斑蝥素的合成：将顺丁烯二酸酐研细，加入乙醚，室温条件下搅拌至溶解，滴入呋喃，室温搅拌24～48小时，呋喃与顺丁烯二酸酐发生Diels-Alder反应，制得去甲去氢斑蝥素；

(2)、N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的合成：将去甲去氢斑蝥素溶于丙酮溶剂中，在搅拌下滴加苯胺的丙酮溶液，反应1小时后加入醋酸锰、三乙胺和醋酐，升温溶解；在50-60℃下反应3～8小时；滤去不溶物，将滤液冷冻，倒入冰水混合物中，析出固体，过滤，滤饼用冰水洗涤，甲醇重结晶，真空干燥；

(3)、在N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺的的C₅和C₆双键上，应用氯胺T的简易方法进行1，3[3+2]偶极环加成，引入五元杂环吡唑环结构，得到吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥酰亚胺衍生物。

反应的化学方程式如下：

本发明的另一方面还提供一种上述吡唑并N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物的活性测试方法，包括以下步骤：

(1)、将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心，用新培养基悬浮重新后用液体分装仪mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞；

(2)、将步骤1的A549细胞在37℃、5％CO₂条件下培养24h后，用自动化液体处理系统Bravo分装药物进行刺激，各种化合物的处理浓度有：16uM 8uM 4uM 2uM 1uM 0.5uM 0.25uM 0.125uM，每种处理有四个重复；