[发明专利]变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用

权利要求书

1.变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如下组分构成：DEPC水，5×AMV buffer，2.5mM/L dNTP，2.5umol/L Mgcl₂，10xPCR Buffer，Nuclease Inhibitor，AMV反转录酶，LA TaqDNA聚合酶，Oligo(dT)18，100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/L TaqMan探针，阳性质粒标准品，阴性对照品，

(1)上下游引物混合物为：按照GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332、PRRSV-FJ04a、PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株的NSP₂序列，用Primer Express5.0软件和Oligo6.0软件设计构建质粒的一对引物和探针，UPPrimer：5’-AGCTGATGACACCTTTGAGT-3’LOW Primer：5’-AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3’，目的片段大小为125bp，

(2)TaqMan探针：

荧光探针序列5’FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3’

(3)阳性质粒标准品：所述的阳性质粒标准品按如下方法获得；

(3.1)GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株序列基因序列的NSP₂段，用Oligo6.0软件设计一对构建标准品质粒的引物U1，UpPrimer：5’-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3’，Low Primer：5’-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3’，目的片段大小为868bp；

(3.2)RNA提取及RT-PCR

病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent说明书进行，其RT-PCR反应体系及条件如下：RT反应体系为10μL:DEPC水1.25μL，5×AMV buffer 2μL，2.5umol/L Mgc12 1.0μL，2.5mmol/L dNTP 1.0μL，Oligo(dT)18 1μL，Nuclease Inhibitor 0.25μL，AMV反转录酶0.5μL，RNA模板3.0μL，反应程序为30℃10min，42℃1h，99℃5min，合成的cDNA置-20℃冰箱保存备用，PCR反应体系为20μL：无菌水13.2μL，10×PCR Buffer 2.0μL，dNTP 1.6μL，LA-Taq酶0.4μL，UP、LOW引物各0.4μL，模板2.0μL，反应程序为95℃预变性5min，94℃变性1min，58.5 ℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；

(3.3)按常规方法对扩增产物进行回收、目的片段连接到PMD-18T Vector及转化到感受态细菌DH5α；

(3.4)阳性克隆鉴定

挑取白色菌落进行小量培养，取1.5ml过夜培养物提取质粒，用HindIII与BamHI进行酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性菌株进一步扩培，菌液测序；

(3.5)质粒定量

取5μl提取质粒稀释到1ml，用核酸蛋白紫外分析仪准确测定OD₂₆₀，然后算出质粒的质量及摩尔浓度，再乘以阿伏加德罗常数，换算成copies/ml，并进行10倍系列稀释，作为标准品-70℃保存。