[发明专利]变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测装置，特别是一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)是20世纪80年代中后期出现的一种新传染性疾病，由猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起，主要表现为母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪出现呼吸道症状，该病于1987首先在美国产生，随后在加拿大，欧州各国和亚州各地迅速流行。我国自1995年年底暴发此病，现已成为危害我国养猪业的主要疫病之一。2006年下半年以来，以江西开始暴发的一种被称为无名“高热病”的猪病在全国各地广泛传播。由于该病来势凶猛，不同品种，不同日龄猪群均可感染发病死亡，给养猪业造成了巨大损失，据报道该疫情主要是由变异型PRRSV引起的，农业部把该病命名为高致病性猪蓝耳病。目前，繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法有多种，如病毒分离、原位杂交和RT-PCR技术等，病毒分离和原位杂交虽然有很高的灵敏度，但操作烦琐，成本较高，周期较长，并且对病料的要求较高，不适应于临床PRRSV的快速诊断；常规RT-PCR检测方示虽然具有方便、快速和敏感等特点，但RT-PCR需要电泳，容易EB或分子污染，并且不能进行定时，定量监测等，而荧光定量RT-PCR方法能克服以上缺点，荧光定量PCR方法是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的新方法，它通过在PCR反应中加入荧光集团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它更具有定时、定量、特异性强、有效解决PCR污染问题等特点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于建立一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。 

本发明的另一目的还在于提供一种上述变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用。 

本发明的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下组分构成：DEPC水，5×AMV buffer，2.5mmol/LdNTP，2.5umol/L Mgcl₂，10xPCR Buffer，Nuclease Inhibitor，AMV反转录酶，LATaqDNA聚合酶，Oligo(dT)18，100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探针，阳性质粒标准品，阴性对照品， 

(1)上下游引物混合物为：按照GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332、PRRSV-FJ04a、PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株的NSP₂序列，用PrimerExpress5.0软件和Oligo6.0软件设计构建质粒的一对引物和探针，UP Primer：5’-AGCTGATGACACCTTTGAGT-3’LOW Primer：5’-AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3’，目的片段大小为125bp， 

(2)TaqMan探针： 

荧光探针序列5’FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3’ 

(3)阳性质粒标准品：所述的阳性质粒标准品按如下方法获得； 

(3.1)GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株序列基因序列的NSP₂段，用Oligo6.0软件设计一对构建标准品质粒的引物U1，Up Primer：5’-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3’，Low Primer：5’-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3’，目的片段大小为868bp， 

(3.2)RNA提取及RT-PCR