[发明专利]测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法

权利要求书

1.一种测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，是按照 下述方法a、方法b和方法c中的任一方法进行测定的：

所述相关制剂为银杏叶、银杏叶提取物或舒血宁注射液；

所述方法a为：

1)制备对照品的溶液：称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每1ml 含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；

2)制备供试品溶液：

(1)制备银杏叶的溶液：取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75％ 的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再 称定重量，用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，量取 续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使其溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml 洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液100ml洗脱，收集洗脱液， 蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用 0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按 照下述方法进行处理：取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加2～3倍重量的水浸泡使其 润湿，装入色谱柱中，用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶液洗脱， 再用去离子水洗脱至中性，接着用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶 液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；

(2)制备银杏叶提取物的溶液：称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产 的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用 孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；

(3)制备舒血宁注射液的溶液：用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过舒血宁注射液， 取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；

3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量：

选用型号为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、规格为50mm×4.6mm、填充剂粒 径为1.8μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以 乙腈和质量百分浓度为0.4％的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别精密吸取所述 对照品溶液与所述供试品溶液各2μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照表1所示进 行梯度洗脱，每次所述梯度洗脱的平衡时间为10分钟，所述流动相的流速为每分钟 0.6ml，检测波长为360nm，所述色谱柱的柱温为40℃，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠 李糖苷峰计算不低于8000，所述表1中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4％的 磷酸水溶液，％代表体积百分比，时间的单位是分钟；

表1、梯度洗脱条件

根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠 李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算：

得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度；

所述方法b为：

1)制备对照品的溶液：称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每1ml 含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；

2)制备供试品溶液：

(1)制备银杏叶的溶液：取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75％ 的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再 称定重量，用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，量取 续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml 洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液100ml洗脱，收集洗脱液， 蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用 0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按 照下述方法进行处理：取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加2～3倍重量的水浸泡使其 润湿，装入色谱柱中，用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶液洗脱， 再用去离子水洗脱至中性，接着用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶 液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；

(2)制备银杏叶提取物的溶液：称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产 的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用 孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；

(3)制备舒血宁注射液的溶液：用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液， 取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；

3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量：

选用型号为HP 1100型ODS-3C18、规格为250mm×4.6mm、填充剂粒 径为5μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以流 动相A和流动相B组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供试品溶 液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照表2所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平 衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，检测的波长为360nm，所述色谱柱 的柱温为30℃，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述流动相A 为由水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1000∶470∶50∶6.08混合而得的混合液， 所述流动相B为水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1400∶200∶30∶6.88混合而得 的混合液；所述表2中，A代表所述流动相A，B代表所述流动相B，％代表体积百 分比，时间的单位是分钟；

表2、梯度洗脱条件

  时间  A   B   0～10  10→10   90→90   10～30  10→25   90→75   30～45  25→25   75→75   45～80  25→70   75→30   80～100  70→100   30→0   100～100.01  100→10   0→90

根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠 李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算：

得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度；

所述方法c为：

1)制备对照品的溶液：称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每 1ml含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；

2)制备供试品溶液：

(1)制备银杏叶提取物的溶液：称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产 的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用 孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；

(2)制备舒血宁注射液的溶液：用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液， 取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；

3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量：

选用型号为Inertsil ODS-3C18、规格为250mm×4.6mm、填充剂粒径为5μm的高 效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和质量百分 浓度为0.4％的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供 试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照表3所示进行梯度洗脱，每次洗 脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，检测的波长为360nm，所述 色谱柱的柱温为30℃，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述表 3中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4％的磷酸水溶液，％代表体积百分比， 时间的单位是分钟；

表3、梯度洗脱条件

  洗脱时间   A   B   0～8   15→15   85→85   8～17   15→17   85→83   17～25   17→17   83→83   25～34   17→20   83→80   34～40   20→20   80→80   40～70   20→35   80→65   70～70.01   35→15   65→85

根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠 李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算：

得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度。