[发明专利]一种联合诊断胃病或评价胃癌风险的酶联免疫吸附试剂盒

权利要求书

1.一种诊断胃病或评价胃癌风险的酶联免疫吸附试剂盒，包括：包被有抗胃蛋白酶原I抗体或抗胃蛋白酶原II抗体的微孔板、酶标抗体、显色剂、终止液、浓缩洗涤液。

2.按照权利要求1所述的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II是从人胃粘膜组织中提取得到的天然蛋白。

3.按照权利要求2所述的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，所述的从人胃粘膜组织中提取得到胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的方法，包括：

(1)收集外科手术切除的正常胃组织，用磷酸盐缓冲液漂洗，分离胃粘膜，吸干，称重，加入磷酸盐缓冲液，捣碎匀浆，离心，收集上清，沉淀磷酸盐缓冲液重悬，再次离心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；

(2)将胃蛋白酶原粗提液加入已经平衡的DEAE-52层析柱，用PBS缓冲液洗脱层析柱至在280nm处，吸光值为0，继续用PBS缓冲液洗脱层析柱，合并洗脱峰，得到含有活性的胃蛋白酶原；

(3)取活性蛋白酶原峰，上样于凝胶层析柱中，用50mmol含0.05mol/LNa₂SO₄的PBS洗脱，流速3.0ml/min，压力为8Kpa，洗脱曲线为显示4个蛋白洗脱峰，第三个蛋白峰即为胃蛋白酶原I，第四个蛋白峰为胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II的混合物；

(4)采用Q-2阴离子交换层析柱分离胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝胶层析后的第四个洗脱峰先用0.05mol/L Tris-HCL，pH7.0透折后上样阴离子层析柱，用浓度为0-0.5mol/L NaCL梯度洗脱，流速为1mL/min；出现三个蛋白峰，其中第1个，2个峰为胃蛋白原原I，第三峰为胃蛋白原原II。

4.按照权利要求1所述的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述的抗胃蛋白酶原I抗体或抗胃蛋白酶原II抗体的制备方法包括：将权利要求2或3所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II免疫小鼠制备融合细胞，得到分泌抗胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的杂交瘤细胞株，培养杂交瘤细胞株，分别得到抗胃蛋白酶原I单克隆抗体或抗胃蛋白酶原II单克隆抗体。

5.按照权利要求4所述的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：所述的抗胃蛋白酶原I抗体或抗胃蛋白酶原II抗体的制备方法包括：(1)融合细胞的制备：用50-100μg权利要求2或3所述的人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II与福氏完全佐剂等体积混合皮下注射免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠，间隔2-3周后，用同样剂量的抗原加强免疫2-3次，末次免疫后3-4天取尾静脉血检测，当效价达到4000以上时，准备融合；将经免疫的小鼠处死后，局部消毒剖腹，无菌条件下取脾，制备成脾细胞悬液；融合前2-3天，将每瓶Sp2/0骨髓瘤细胞传至4瓶细胞，取处于对数生长期的细胞用于融合；将脾细胞和SP2/0细胞分别计数后，按7∶1的比例加入离心管中混合均匀，离心，倒尽上清液，使两种细胞混匀成糊状，加入预温的50％PEG4000，边滴加边搅拌完成细胞融合；

(2)融合后的细胞用含20％小牛血清的HAT培养液制备成细胞悬液，分划于192孔细胞培养板中进行选择培养；在选择培养液中培养4天后，其它细胞逐渐消失，只有融合的杂交瘤成簇生长，形成小的细胞集落，8天后，停止使用HAT培养液，改用HT培养液，一周后换用含10％牛血清的DMEM培养液培养；待杂交瘤细胞长满培养孔底部的1/3时，这时吸取培养上清进行筛选。用间接酶联吸附法(ELISA)进行特异性抗体检测，有分泌抗ALB抗原抗体的杂交瘤细胞；

(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II为包被抗原，用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照，以细胞培养板中未长出克隆的培养上清为阴性对照；选取对胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗原阳性反应的杂交瘤细胞集落，以有限稀释法进行克隆化培养，选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续按有限稀释法进行2次克隆和扩大培养，得到分泌特异抗体的杂交瘤细胞株；

(4)在同系的6周龄BALB/c腹腔注射液体石蜡，约第8天将克隆后分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞注入腹腔，待小鼠腹部开始增大后，收集腹水；一只小鼠收集腹水2-3次后，杀死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，无菌过滤后，小包装分装冻存，亦可取部分进一步进行纯化；

(5)离心除去腹水中的细胞和细胞碎片，加入等体积的饱和硫酸铵到上清液中，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时，使蛋白质充分沉淀，将沉淀物溶于少量的PBS中，用10mmol/LPBS透析；然后通过DEAE-Sephadex A52层析柱，收集并合并洗脱液中含蛋白的部分，即得到纯化的抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II单克隆抗体。