[发明专利]一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物多糖的提取，特别涉及一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇 多糖的方法及其测定方法。

背景技术

目前，提取食用菌多糖常用的方法有：热水浸提法、微波辅助法、超声 波辅助法和酸碱浸提法，这些方法均有一定的不足之处。其中，热水浸提法 需要温度在80-100℃，处理时间在60-180min，处理温度比较高、时间比较 长，容易使多糖发生变性失活；微波辅助法是利用微波的吸收性、穿透性和 反射性使极性物质，如水等选择性吸收，从而被加热，增加物料的通透性， 使得多糖等活性物质从组织中释放出来，其实质也是利用加热提取多糖，所 以容易使多糖发生变性失活；超声波辅助法是利用其在溶剂中产生的空化作 用，导致溶液内空穴的形成、增长和爆破压缩，从而是固体样品破碎，增大 样品与萃取剂之间的接触面积，提高目标产物从固相转移到液相的传质速率， 其实质是破碎细胞壁，溶出目标产物，但是在实际操作的过程中，利用超声 波破碎食用菌细胞壁，效率非常低，致使多糖的提取率也比较低；酸碱浸提 法虽然可以缩短提取时间，但由于酸、碱在浓度因子难以控制的情况下，容 易使部分多糖发生水解，从而破坏多糖的活性结构，降低多糖得率。经查阅 文献，以上提取方法的多糖提取率在9-15mg/g。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多 糖的方法。

本发明的技术方案是：

一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于：

使用原料：鲜双孢蘑菇；

使用试剂：苯酚、浓硫酸、葡萄糖、硫酸铵(NH₄)₂SO₄、聚乙二醇(PEG)6000、 蒸馏水；

使用仪器设备：10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机；

分离方法及步骤

(1)材料预处理：将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；

(2)热水浸提粗多糖：将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢 或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取 上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min， 再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水 定容至1000mL备用；

(3)双水相萃取操作：精确称取聚乙二醇(PEG)6000 2.66g，硫酸铵 4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为 对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体 积为9.5mL，下相体积为14.5mL；

得到的双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。

本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，最佳的条件为：PEG6000的质 量百分数为13.3％，(NH₄)₂SO₄的质量百分数为21.4％，pH值为7，温度为25℃， 在一个大气压条件下操作。

本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的测定方法，其特征在于：

使用仪器：UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平；

(1)苯酚-硫酸法测定多糖含量：分相后上下相各取1mL加9mL水稀释 10倍，再取1mL稀释液加0.5mL 6％苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min， 用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值；上相吸光度为 0.369，下相吸光度0.06；

(2)标准曲线的制作：准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至 500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容 好的葡萄糖溶液0.1mL放入1号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL 放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加 入事先配制好的6％苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀；静置30min， 后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图；

数据如表1

表1标准曲线吸光度值

(3)数据计算