[发明专利]用于磁共振活体示踪的超顺磁性纳米铁颗粒标记的细胞

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于磁共振活体示踪的超顺磁性纳米铁颗粒标记的细胞。

背景技术

干细胞、祖细胞等多种细胞治疗在临床的应用越来越广泛。无创性活体示踪接种的治疗细胞，对接种细胞的存活、分化和在损伤的组织器官定位进行长期监控成为治疗能否成功的关键之一。磁共振成像技术(MRI)具有高度时间和空间分辨力，同时可以提供机体解剖和功能方面的信息，目前已经成为活体示踪细胞的重要手段。超顺磁性纳米铁颗粒(以下简称SPIO)标记是磁共振活体示踪细胞的主要方法，被广泛应用于基础科研和临床前研究。但SPIO标记的细胞随着细胞分裂和铁颗粒的代谢降解，磁共振信号逐渐减弱至消失，无法长期示踪治疗细胞。铁蛋白广泛存在于生物细胞内，参与机体铁代谢，具有储存铁的功能。近年来，有关铁蛋白基因作为磁共振报告基因的研究倍受关注。其原理是：人工将铁蛋白基因导入细胞使细胞高表达铁蛋白，高表达的铁蛋白将机体细胞外内源性铁捕获，在胞内形成具有超顺磁性的结晶铁，在磁共振下产生对比。但是，铁蛋白产生的磁共振信号非常弱，很难应用于临床。

发明内容

本发明提供一种用于磁共振活体示踪的SPIO标记的细胞，磁共振信号强，且可长期示踪。

所述用于磁共振活体示踪的SPIO标记的细胞中，所述细胞为高表达铁蛋白细胞。

所述SPIO标记的细胞由SPIO与高表达铁蛋白细胞共同培养得到，SPIO的标记浓度为30～60μg/mL。

所述高表达铁蛋白细胞为铁蛋白基因质粒转染细胞。所述铁蛋白基因质粒优选为铁蛋白重链全基因质粒。

所述铁蛋白重链全基因质粒的构建方法为：将mRNA进行逆转录、聚合酶链反应，扩增出铁蛋白重链全基因片断，将铁蛋白重链全基因插入到载体中，构建铁蛋白重链全基因质粒。作为优选方案，所述铁蛋白重链全基因质粒的构建方法为：将mRNA逆转成cDNA，根据铁蛋白重链基因序列，应用含有限制性内切酶位点的聚合酶链式反应引物，扩增出铁蛋白重链全基因片段，应用限制性内切酶对铁蛋白重链全基因片段和载体pcDNA3.1进行消化，对消化产物进行纯化后将铁蛋白全基因插入载体pcDNA3.1形成铁蛋白重链全基因质粒。更优选的方案是，所述载体为pcDNA3.1，所述铁蛋白重链全基因质粒的构建方法为：将mRNA逆转成cDNA，根据铁蛋白重链基因序列，应用含有NotI和BamHI限制性内切酶位点的聚合酶链式反应引物，扩增出铁蛋白重链全基因片段，应用NotI和BamHI限制性内切酶对铁蛋白重链全基因片段和载体pcDNA3.1进行消化，对消化产物进行纯化后经T4连接酶将铁蛋白全基因插入载体pcDNA3.1形成铁蛋白重链全基因质粒。对于人鼠铁蛋白重链全基因质粒的构建，优选的聚合酶链式反应引物序列如下：

上游引物序列：5′-ataagaatgcggccgctaaactataccatgaccaccgcgtctccctc-3′；

下游引物序列：5′-cgcggatccgcgttagctctcatcaccgtgtcccag-3′。

本发明中，所述磁共振活体示踪细胞为胶质瘤C6细胞，得到铁蛋白基因质粒转染磁共振活体示踪细胞的方法为：

(1)将胶质瘤C6细胞接种于培养基中，在细胞培养孔中培养，使胶质瘤C6细胞达到90％融合度；

(2)转染：铁蛋白基因质粒与转染剂混合、室温孵育后，加入所述细胞培养孔，轻轻混匀培养过夜；

(3)转染24hr后消化细胞进行1∶10传代，最后筛选。

所述转染剂为Invitrogen公司生产的Lipofectamine 2000。

经研究证实，高表达的铁蛋白可以将SPIO降解的铁作为额外的铁源摄取和储存在细胞内。细胞接种后不同时间点的磁共振扫描信号强度，与细胞内铁原子浓度结果相符。铁蛋白可以与细胞标记的SPIO作用，延长SPIO活体示踪细胞的时间；同时降解的SPIO可以加强铁蛋白报告基因的信号强度。两者联合使用，可以增强对标记细胞的活体示踪时间和磁共振信号强度。本研究结果对于进行临床细胞治疗和基因治疗，对治疗细胞的定位、存活和生长情况实时检测具有一定的应用价值。

附图说明