[发明专利]一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏羽衣甘蓝的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏羽衣甘蓝的方法。

背景技术

观赏羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)，属十字花科二年生草本植物，是芸薹属甘蓝种的园艺变种。以观叶为主，其叶片形态美观多变，心叶色彩绚丽如花，整个植株形如盛开的牡丹花，人们形象地称之为“叶牡丹”。其抗寒性很强，能耐受-8℃左右的低温，近来在许多城市，尤其是长江流域及黄河以南城市，已成为秋冬至早春的主要景观地被植物。我国目前种子基本依靠进口，国内稀有育种工作。

观赏羽衣甘蓝的部分生长期处于虫害发生严重季节，一方面害虫咬食的结果，造成了观赏性的严重破坏，另一方面，大量喷施杀虫剂，也易造成环境污染及害虫抗药性的形成。此外，作为观赏植物，通常大片栽种于户外露地，人工除草是一个耗时耗工的劳动。因此培育抗虫、抗除草剂的观赏羽衣甘蓝具有重要的社会及经济价值。

在甘蓝类作物中，几乎不存在抗虫种质，更不存在抗除草剂种质。采用基因工程手段，引入抗虫及抗除草剂基因，是培育抗虫兼抗除草剂品种的最直接、有效的手段，而且由于是单基因的引入，也保证了其观赏性状不受影响。

目前国际上使用较多的杀虫基因有来自苏云金杆菌的Bt基因，也有部分工作中采用了来自植物的蛋白酶抑制剂基因，而这两个基因的杀虫机理不同。将不同杀虫机理的杀虫蛋白基因同时导入同一受体植物，有可能提高植物的抗虫性，并延缓昆虫对杀虫蛋白产生耐受性。国际上使用较多的抗除草剂基因是来自于细菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因，它编码对除草剂Basta中有效成分PPT(Phosphinothricin)的抗性。

在优良育种材料中建立高效组织培养离体再生体系是开展基因工程种质改良的基础。我们已经在几份优良育种材料中建立了高频率的不定芽诱导及植株再生技术(赵秀枢等，2009)，而国内外尚未见利用转基因技术培育抗虫、抗除草剂观赏羽衣甘蓝的有关报道。

甘蓝类作物具有很强的杂种优势。生产中使用的种子均为杂交一代。在杂交育种中，首先必须获得纯合的双亲材料，常规育种需要经过6-10年时间。由于植物的花粉细胞(小孢子细胞)仅具有一套染色体，通过小孢子培养可以一步获得双单倍体纯合植株，仅需1-2年时间，能大大加速育种进程。我们已经建立了观赏羽衣甘蓝小孢子培养技术，并获得了相应的国家发明专利(ZL 2006 1 0112997.5)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育转基因甘蓝的方法。

本发明所提供的培育转基因甘蓝的方法，包括如下步骤：用含有目的基因的重组农杆菌侵染甘蓝的子叶，再进行共培养，得到转基因甘蓝。

上述过程中，所述甘蓝的子叶为带柄子叶；所述柄的长度为1mm-4mm；所述柄的长度具体为1mm、2mm或4mm。

上述过程中，所述侵染包括如下步骤：将所述甘蓝的子叶置于所述含有目的基因的重组农杆菌的菌液中，浸泡3min-5min，得到侵染后的子叶。

上述过程中，所述含有目的基因的重组农杆菌的菌液的OD₆₀₀值为0.3-0.5。

上述过程中，所述共培养的方法包括如下步骤：将所述侵染后的子叶置于共培养培养基中，在温度为22℃-27℃且黑暗的条件下培养2天；

所述共培养培养基由NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、烟酸、甘氨酸、硫胺素(即VB1)、盐酸吡哆辛(即VB6)、6-苄氨基腺嘌呤(即6-BA)、α-萘乙酸(即NAA)、蔗糖、琼脂、乙酰丁香酮和水组成；