[发明专利]一种基于转化体的分泌型RpfB因子的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于转化体的分泌型RpfB因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以包含RpfB基因的载体或基因组为模板，以引物对P为引物，PCR扩增RpfB基因；所述的引物对P为：

上游引物P1：gcctcgagat gttgcgcctg gtagtc         ；

下游引物P2：tagcggccgc tcaacgtgca cctgctcgtg ca  ；

2)将PCR扩增的RpfB基因用XhoI和NotI双酶切得到线性化的片段；并将该线性化片段与被XhoI和NotI双酶切的pPIC9K载体片段连接得到重组酵母表达载体pPIC-RpfB；将重组酵母表达载体pPIC-RpfB转化到感受态的毕赤酵母，筛选得到目的载体阳性表达的阳性转化子；

3)将阳性转化子在BMGY培养基中30℃、200r/min条件下培养，当OD600达到2.0～6.0时，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬进行诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为0.5％，30℃、200r/min条件下继续培养96～120h后收集培养上清液；

4)将收集的培养上清液通过层析分离纯化得到RpfB因子。

2.如权利要求1所述的基于转化体的分泌型RpfB因子的制备方法，其特征在于，重组酵母表达载体pPIC-RpfB包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的基于转化体的分泌型RpfB因子的制备方法，其特征在于，重组酵母表达载体pPIC-RpfB转染感受态毕赤酵母为：

将酶切线性化的重组酵母表达载体pPIC-RpfB与感受态毕赤酵母混合后，滴加于0.1cm电转杯中，冰水浴5min，在电压1800V、电容25uF、电阻200Ω条件下电击转化；

电击后，立即加入1ml浓度为1mol/L预冷的山梨醇，混匀，30℃条件下静置2h，涂布于MD平板，30℃培养2～3天，直至出现菌落。

4.如权利要求1所述的基于转化体的分泌型RpfB因子的制备方法，其特征在于，所述的培养上清液通过凝胶层析分离纯化为：

将收集的培养上清液浓缩后上样于阴离子交换层析柱，用含0～1mol/LNaCl、pH为8.0的20mmol/L Tris-HCl为洗脱液进行洗脱分离，收集包含RpfB因子主峰的粗纯化洗脱液；

将收集的粗纯化洗脱液经浓缩、脱盐后上样于凝胶过滤层析柱，用含0.25mol/L NaCl的pH 7.0、20mmol/L PBS洗脱分离，收集包含纯化RpfB因子主峰的洗脱液。

5.一种转化体，其特征在于，该转化体的宿主细胞为毕赤酵母Pichiapastoris SMD1168，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含RpfB基因的重组酵母表达载体pPIC-RpfB。

6.如权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述的重组酵母表达载体pPIC-RpfB是以包含RpfB基因的载体为模板，以引物对P为引物，PCR扩增RpfB基因，然后将RpfB基因用XhoI和NotI双酶切得到线性化的片段，并将该线性化片段与XhoI和NotI双酶切的pPIC9K载体片段连接而得到。

7.分泌型的RpfB因子应用于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的复苏和促生长。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌是临床痰标本中的结核分枝杆菌。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，分泌型的RpfB因子的浓度为5～1000pM。

10.分泌型的RpfB因子应用于耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和结核休眠菌的复苏与促生长。