[发明专利]创伤弧菌核酸定量检测试纸条

权利要求书

1.一种水产品中创伤弧菌基因诊断定量检测方法，其特征是：

(1)待测菌株的特异性引物的设计、筛选和制备；

(2)与特异性扩增产物能够特异性结合的探针序列的设计、筛选和制备；

(3)核酸扩增后利用上转换磷光技术进行定量检测的核酸层析检测试纸条。

2.权利要求1中所述创伤弧菌特异性引物，其特征在于，该引物的靶基因为创伤弧菌溶细胞素结构基因vvhA。所述引物与vvhA的350位～800位的核苷酸的一部分或其互补链互补。

3.权利要求1中所述引物的组成：

正向引物vvhA1：ccgcacttacattggtcc

反向引物vvhA2：tagggttgaacttcgtctta，并且vvhA1正向引物或vvhA2反向引物以生物素或地高辛标记，可以扩增vvhA的350位～800位的核苷酸。

4.权利要求1中所述探针，其特征在于，该探针与利用权利要求2中vvhA的350位～800位的核苷酸的一部分或其互补链互补，该探针的序列为：vvp：gccgtctttgttcacttccgc

5.权利要求4中所述探针，标记了FITC。

6.权利要求1中所述核酸扩增产物定量检测试纸条，包括检测试纸和反应缓冲液，其特征在于所述的标记物为上转磷光颗粒(UCP)。

7.根据权利要求6所述的核酸扩增产物定量检测试纸条，其特征在于试纸条检测线上固定了生物素或地高辛抗体。

8.根据权利要求6所述的核酸扩增产物定量检测试纸条，其特征在于UCP标记的为FITC抗体。

9.根据权利要求1所述的创伤弧菌检测方法，其特征在于，其具体检测方法为：

(1)样品处理和模板提取

取水产品除壳组织高速匀浆处理，取匀浆物增菌液增菌12h，取1.5Ml增菌液10000rpm离心5min后弃上清，加入30μL双蒸水煮沸5min，12000rpm离心10min后取上清2μL做为待检模板DNA。

(2)创伤杆菌目的片段的扩增

取扩增反应液，依次加入反应缓冲液、vvhA1、vvhA2、模板、酶，最后双蒸水，形成总体积20-100μL的反应体系，混匀，瞬时离心后反应程序为94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃30s 30个循环，72℃6min，最后置于100灭活酶5min。

(3)探针杂交

在上述扩增产物中加入探针，终浓度为1μM，加入后反应程序为98℃30s，58℃20min。

(4)将上步杂交产物加入反应缓冲液混匀，加入试纸条样品吸收区中，与UCP标记物结合。

(5)5～15min后，观察终点指示窗确定反应结束，以UPT生物传感器扫描结果扫描窗，得到相应检测结果。

10.一种检测创伤弧菌核酸定量检测试剂盒，试剂盒包括：引物vvhA1，vvhA2，探针vvp，PCR反应缓冲液，探针杂交缓冲液，含有UCP标记的FITC抗体、抗生物素或地高辛抗体、阳性对照抗体的试纸条。