[发明专利]创伤弧菌核酸定量检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于上转换磷光(UPT)核酸层析技术的水产品中创伤弧菌基因诊断定量检测试纸条，特别涉及对创伤弧菌特定基因片段具有特异性的引物及探针；还涉及将上述引物及探针用PCR扩增法检测水产品创伤弧菌的上转换磷光核酸层析检测方法和检测试剂盒。该检测方法用以灵敏、快速、定量检测水产品中创伤弧菌。

背景技术

创伤弧菌是海洋和盐湖中广泛分布的一种嗜盐性病原菌，该菌对于糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、肝炎及原因不明的肝功能障碍，艾滋病或其它重病患者的危害相当严重，特别是对原发性败血症病例，死亡率超过50％。目前世界上大部分沿海国家都有创伤孤菌感染的病例报告。创伤弧菌的感染途径有两个：一是经口感染，引起原发性败血症，这主要是由于食用生的或未经充分加工的贝类引起的；二是通过皮肤伤口侵入，在原皮肤伤口处形成红肿、红斑和剧烈疼痛，发展迅速，最终引起败血症，这主要是由于伤口接触存在创伤弧菌的贝类或海水引起的。欧盟已要求对从我国进口的水产品检测创伤弧菌，因此，开展水产品中创伤弧菌的污染情况调查，研究快速检测和分离创伤弧菌的方法显得尤为重要。

创伤弧菌传统的检测方法是通过首先使用创伤弧菌增菌培养基碱性蛋白胨水(APW)或添加多粘菌素B的APW增菌12～16h，改良纤维二糖多粘菌素B多粘菌素E琼脂或纤维二糖多粘菌素E琼脂划线培养18h～24h，挑取可疑菌落以3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂接种，挑菌后进行生化实验，或选用API 20E诊断试剂条。传统方法经过多个筛选步骤，需要多种培养基，耗时较长；另有利用vvh单克隆抗体检测的方法，该方法要求挑取单一的菌落大量增菌后利用免疫学方法鉴定，特异性较高，但两种方法检测所需时间均较长，为了尽量减少人类因接触或食用创伤弧菌污染的水产品，建立灵敏、特异的检测方法对保护人类健康极为重要。

创伤弧菌基因检测技术为病原菌的快速检测提供了有力的工具，也是未来创伤弧菌检测方法研究的一个重点。本发明将创伤弧菌基因检测技术与核酸扩增产物层析检测法相结合，建立了快速、灵敏度高的创伤弧菌基因诊断定量检测试纸条。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种对创伤弧菌特定基因片段具有特异性的引物。

上述目的是通过如下技术方案实现的。

一种创伤弧菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因特异性碱基序列，所述靶基因为创伤弧菌溶细胞素结构基因vvhA。所述引物与vvhA的350位～800位的核苷酸的一部分或其互补链互补。

所述引物由下列引物组成：

正向引物vvhA1：ccgcacttacattggtcc

反向引物vvhA2：tagggttgaacttcgtctta

特别地，vvhA1正向引物或vvhA2反向引物以生物素或地高辛标记，可以扩增vvhA的350位～800位的核苷酸。

为增加反应的特异性，本发明还提供一条探针，此探针与vvhA的350位～800位的核苷酸的一部分或其互补链互补，该探针的序列为：

vvp：gccgtctttgttcacttccgc

并且，该探针标记了FITC。

本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物和探针基于聚合酶链式反应法检测创伤弧菌的检测方法及检测试剂盒。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种创伤弧菌的检测方法：该方法用于检测水产品中的创伤弧菌，其特征在于，以创伤弧菌溶细胞素结构基因vvhA350位～800位的核苷酸的一部分或其互补链互补为靶，通过PCR法用上述引物选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。

PCR扩增产物本实验选取了快速定量检测核酸扩增产物的检测试纸条，包括由样品吸收区、结果扫描窗和终点指示窗构成的检测试纸和反应缓冲液，快速定量检测核酸扩增产物试纸条分为底板、玻璃纤维层、抗体吸附膜及吸水纸，快速定量检测核酸扩增产物的方法包括包被标记物抗体、核酸扩增标记上转磷光检测。

试纸由样品垫、抗体吸附膜、吸水纸、粘性底衬、试纸条外壳组成，其中生物素或地高辛抗体吸附于抗体吸附膜，样品经上转磷光标记试剂标记，过程包括标记生物素或地高辛特异性引物扩增，标记FITC特异性探针与扩增产物杂交，上转磷光颗粒标记FITC抗体特异性结合FITC，加样于加样区，标记实验结果由UPT生物传感器分析判读。

具体检测方法为：

(1)样品处理和模板提取