[发明专利]应用肿瘤特异性启动子表达报告基因来检测循环血中肿瘤细胞的方法和试剂

说明书

大多数癌症患者死于肿瘤转移，转移是指肿瘤细胞通过循环系统从原发部位扩散到远离部位，并在新的器官中繁殖生长成新的转移瘤(Ecclesand Welch，2007)。据估计，每克肿瘤组织每天约有106细胞进入血液(Chang et al.，2000；Butler and Gullino，1975)，不过这其中的大部分很快会清除(Butler and Gullino，1975；Luzzi et al.，1998)。但是，众所周知，肿瘤细胞的侵入和转移在早期就会发生，甚至在癌症确诊前的很多年就会发生。因此，检测血液中的循环肿瘤细胞是癌症早期诊断的有效方法(Husemannet al.，2008；Gray，2003；Kohn and Liotta，1995)。另外，最近一项研究表明手术前的循环肿瘤细胞(CTC)水平与癌症患者的总存活期存在相关性，而且术前术后循环肿瘤细胞数量的比较可能是治疗反应的指示剂(Scher et al.，2009；de Bono et al.，2008)。因此，有效的检测循环血中肿瘤细胞不仅有益于癌症的早期诊断，而且对预后和治疗反应很有帮助。

目前检测循环血中肿瘤细胞的方法有三种：1)检测上皮细胞特异性蛋白的免疫测定；2)基于分子测定的检测肿瘤或上皮细胞特异性mRNA的PCR方法；3)检测与癌症有关的染色体畸变或基因扩增的荧光原位杂交。

免疫测定是通过使用固定在磁性颗粒上的抗体来捕获表达某些组织、器官或肿瘤特异性抗原的细胞。由于大多数实体瘤来自上皮细胞源的细胞，因此在上皮细胞中特异性表达的蛋白(如角蛋白cytokeratins(19，8，18and 20)和EpCam(Litvinov et al.，1994))已经被用作区分上皮细胞病和有核血细胞的生物标志物。但是，这个方法可能会导致一些假阳性或假阴性结果。第一，因为入侵的肿瘤细胞因上皮细胞向间质细胞转变，而丢失原有的上皮抗原，这将导致假阴性结果(Willipinski-Stapelfeldt et al.，2005；Went et al.，2004)。第二，非肿瘤上皮细胞可能会存在于血液中，或者抗体可能会非特异性地与血细胞结合，这将导致假阳性结果。据估计，在正常对照中，约0％-20％的角蛋白cytokeratin阳性细胞是白细胞(Goeminne etal.，2000)。同时用血细胞特异性的抗体(如CD45)对染可能会减少假阳性。抗器官特异性标志物的抗体，如前列腺特异抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)，mucin-1(MUC-1)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚蛋白(AFP)，HER-2，也被用来检测循环肿瘤细胞，不过由于不是所有的肿瘤细胞都表达那些生物标志物，所以经常会产生假阴性结果。但是此方法的优点是可以用别的方法，如形态学、mRNA或基因扩增测定，来富集和分析磁性颗粒捕获的循环血肿瘤细胞。循环血肿瘤细胞也可以通过其物理特性(如大小和密度)富集。大部分血白细胞(淋巴细胞和中性粒细胞)的大小是8～11um，而乳腺癌患者血液中肿瘤细胞的平均直径是29～35um(Meng et al.，2004)。

使用荧光原位杂交(FISH)，比较基因组杂交(CGH)和突变分析等染色体组学分析可以进一步证明癌症是相关的染色体畸变、基因扩增、突变的存在(Swennenhuis et al.，2009；Leversha et al.，2009)。但是这些方法通常费用昂贵，而且耗时。反转录PCR(RT-PCR)，尤其是实时定量反转录PCR，是一种敏感的、实际的，用来检测某些组织或器官(如上面提及的上皮细胞和器官特异性蛋白)的mRNAs特异性的方法(Kitago et al.，2009；Iakovlevet al.，2008)。此方法可以与免疫测定法结合使用。例如，与免疫磁珠富集的循环血肿瘤细胞可以被进一步分析它们的组织或肿瘤特异性mRNAs的含量。虽然PCR方法在检测信号方面灵敏度高，但是需要采取严格的控制，避免过程中可能会产生的污染。

由于缺乏高肿瘤特异性分子，免疫测定法和定量反转录PCR法的应用受到限制，因此测定循环血肿瘤细胞的存在需要分析多种分子标志物。