[发明专利]利用超声结合EDTA溶液去除狂犬病疫苗制品中残留DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在疫苗制品中去除宿主DNA及杂蛋白的方法，具体说是利用超声结合 EDTA溶液去除狂犬病疫苗制品中残留DNA的方法。EDTA溶液是一种络合剂，化学名 称为乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠，本发明中提到的EDTA可以是乙二胺四乙酸， 也可以是乙二胺四乙酸二钠，或者是二者的混合物。

背景技术

狂犬病疫苗是将狂犬病毒接种于适合的动物细胞上，经繁殖后病毒释放到培养液 中，此间一些残余的宿主细胞或其碎片也会随着混在培养液中.经澄清，滤过，浓缩纯化后， 提取得到狂犬病病毒疫苗原液中，会产生游离的宿主DNA及与抗原蛋白结合的宿主DNA， 原液中还含有大量的宿主蛋白，浓缩纯化工艺会将一定比例的游离的DNA除去，但仍会 有残余DNA存在，特别是与病毒或抗原蛋白结合的DNA会残留在纯化原液中，如去除不 彻底，这部分DNA会随着疫苗一起被注入到人体内，可能会在人体内引起不良反应，或具 有导致癌症发生的可能。

目前狂犬病疫苗传统工艺的提取普遍采用简单超滤浓缩、分子筛层析纯化，使用这 种工艺提取得到的狂犬病疫苗，存在以下缺陷：

1、病毒疫苗提取后残留的宿主DNA含量过高。

2、病毒疫苗在提取后仍含有过高的宿主蛋白，去除杂蛋白率不高，导致疫苗在临床 使用后有较大的副作用。

3、上述缺陷，影响了病毒疫苗产品的质量，制约了疫苗产品的生产。

为此许多人在提取过程中，改变超滤浓缩的倍数，对层析柱连接方式进行尝试，对 平衡盐pH值进行调节，比如使用传统工艺的分子筛层析对狂犬病疫苗浓缩液进行纯化， 具体例如，选取超滤浓缩25倍的狂犬病疫苗浓缩液(指浓度是收获液的25倍)40ml， 批号是S-20100201，通过XK50层析柱，Sepharose 4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统 检测范围设定为0.2A，输出设定为100mV，记录仪纸速设定为2cm/h。用pH7.6的 10mmol/L PBS作流动相，收集第一个吸收峰，即狂犬病病毒蛋白吸收峰，收集到的狂 犬病疫苗纯化液批号为S-20100202。将S-20100201、S-20100202分别经行抗原含量、 DNA残留量检测。检测数据见表1，DNA杂交膜见附图5，分子筛层析纯化图谱见附图 1；

再比如，使用超声波细胞粉碎机超声处理狂犬病疫苗浓缩液，再使用传统工艺的分 子筛层析纯化对超声处理后的狂犬病疫苗浓缩液进行纯化，具体例如，选取超滤浓缩25 倍的狂犬病疫苗浓缩液(批号S-20100201)40ml，使用Φ6变幅杆的Scientz-IID型超 声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓缩液进行超声处理，在冰浴保护下进行超声，保证浓缩 液温度不超过26℃，设置超声功率为600W(64％)，工作时间2s，间隙时间3s，总工 作时间20min(240次)，得到的超声后浓缩液批号为S-20100203。按照上述同样方法 处理狂犬病疫苗浓缩液40ml，通过XK50层析柱，Sepharose 4FF凝胶层析纯化，紫外 检测系统检测范围设定为0.2A，输出设定为100mV，记录仪纸速设定为2cm/h。用pH7.6 的10mmol/L PBS作流动相，收集到纯化液S-20100204。将S-20100203、S-20100204 分别经行抗原含量、DNA残留量检测。检测数据见表1，DNA杂交膜见附图5，分子筛 层析纯化图谱见附图2。

结果仅取甚微的效果，没有在实质上解决问题。

发明内容

为了实现在处理狂犬病疫苗的过程中尽可能不损失抗原，即不影响疫苗制品的药 效，有效地去除杂蛋白及残留宿主DNA的目标，本发明的目的在于提供一种方法，即向 狂犬病疫苗浓缩液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，以期达到保护病毒，分散病毒团块， 再使用一定频率及一定强度的超声波处理，将DNA分子打成小片段，再用分子筛柱层析达 到将小分子DNA片段去除的目的.从而达到成品狂犬病病毒疫苗DNA残余量达到合格标 准。

本发明的技术方案如下：

本发明的技术方案是：以狂犬病疫苗浓缩液为原料，向狂犬病疫苗浓缩液中加入 EDTA溶液，加入后使EDTA的最终浓度为0.5-1000mmol/L，二者反应后，再使用超声 波细胞粉碎机超声处理狂犬病疫苗浓缩液，最后使用分子筛层析纯化对超声处理后的狂 犬病疫苗浓缩液进行纯化。