[发明专利]一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒，其特征在于：

以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液；以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成试剂盒。

2.权利要求1所述检测相思子毒素化学发光试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

采用凝胶层析法从相思子中制备相思子毒素，用甲醛减毒处理制备类毒素，分别免疫家兔和Balb/C小鼠制备多克隆抗体和单克隆抗体；以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液；以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成试剂盒。

3.权利要求2所述的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)采用5％冷醋酸液抽提，并用35％～95％硫酸铵分级沉淀制备相思子毒素粗毒；再经Sepharose 6B亲和层析，DEAE-Sepharose FF离子交换层析以及Superdex 75凝胶过滤三步层析，制备相思子毒素；

(2)将从步骤(1)中制备得到的相思子毒素用1％甲醛减毒处理制备类毒素，用于免疫Balb/C小鼠制备单克隆抗体；

(3)采用Westerblot方法从步骤(2)中制备得到的单克隆抗体中筛选出特异性结合相思子毒素A链的单克隆抗体；

(4)用步骤(3)得到的单克隆抗体包被发光板，10％的羊血清封闭制备发光板；

(5)将步骤(2)中制备得到的相思子毒素类毒素免疫家兔制备兔源抗相思子毒素多克隆抗体；

(6)配制化学发光底物液、酶标抗体、稀释液、10倍浓缩洗涤液；

(7)将特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板；

(8)以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体；

(9)利用步骤(8)中包被好的化学发光板及步骤(9)中制备得到的酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液，以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成试剂盒。

4.权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于相思子毒素的制备步骤如下：

相思子去壳处理，去种仁200g，浸于115％冷醋酸中，4℃过夜，高速匀浆处理，10000g/min离心20min，上清用35％～95％硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解于5mmol/LPB(pH8.0)溶液中，用Sepharose 4B亲和层析纯化，纯化产物过DEAE-Sepharose FF离子交换柱，收集第一个洗脱峰即为相思子毒素，经脱盐处理后加入终浓度为0.01％硫柳汞钠盐，-20℃保存。

5.权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于兔源抗相思子毒素的多克隆抗体制备方法：

相思子毒素经甲醛减毒处理，分三次免疫家兔，首次免疫剂量为500μg/只，加强免疫于首次免疫2周后进行，剂量为300μg/只，加强免疫每间隔2周进行一次，8周后用不含佐剂的类毒素溶液经耳静脉注射作超强免疫免疫，剂量为800μg/只，一周后心脏穿刺采血，分离血清，血清经50％硫酸铵盐析沉淀法处理，5000g/min离心20min，弃上清，沉淀用PBS(0.02mol/L pH7.0)重悬，即为粗提的多克隆抗体，粗提物用HitraprProtein A FF或Hitrap rProtein G FF预装柱制备高纯度的抗体。

6.权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体制备方法如下：

相思子毒素用1％甲醛减毒处理，对6～8周龄的Balb/C小鼠免疫，通过细胞融合，ELISA筛选，克隆，并采用Westerblot法鉴定其特异性，取经Westerblot鉴定为能分泌特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体的细胞株，采用体外诱导法，将单克隆抗体细胞株扩大培养后注入6～8周龄Balb/C小鼠腹腔内制备腹水，制备的腹水经硫酸铵盐析法粗提后，用Hitrap rProtein A FF凝胶亲和层析柱进一步纯化，即得单克隆抗体。