[发明专利]一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒，本发明还提供了该试剂盒的制备方法。

背景技术

相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(Abrus Precatorius L.)的种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素(ricin)同为II型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员，是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一，毒性是普通化学武器的几百倍。由于不同产地或品种，同种植物所含毒素的结构和性质可能稍有不同，台湾产的相思子中同时分出四种相思子毒素异毒素：abrin-a、abrin-b、abrin-c及abrin-d，相对分子质量介于63kDa～67kDa之间，其中abrin-b和abrin-c由于其B链凝集活性低而只有较弱的细胞毒性作用，而abrin-a、abrin-d则有极强的细胞毒性，成年人摄入的致死剂量为5.0～7.0μg/Kg，只需嚼烂后吞服一粒种子即可被毒死，而且出现症状时已经造成机体严重的器质损害，给中毒的治疗及预防带来极大的困难，因此开展对相思子毒素检测技术的研究具有十分重要的意义。

国内外有关相思子毒素的生物检定法和物理化学检定法报导较少，免疫学检测主要有放射性免疫法(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。RIA技术主要是通过使用放射性元素¹²⁵I标记的抗体来定量检测血液等样品中的相思子毒素，检测灵敏度高，血浆中相思子毒素最小可测浓度达50～100pg/mL。其缺点是存在放射污染问题。HPLC法用于蛋白质鉴定及检测特异性较好，但由于需要昂贵的设备及较多的专业技术，通常多用于实验室确证分析，不适合大批量样品的现场筛检。ELISA法检测相思子毒素灵敏性和特异性较高，可定量分析，曾广泛用于大批量样品的现场筛检。本发明的检测相思子毒素化学发光试剂盒，通过检测发光底物产生的光信号代替传统ELISA中的显色底物，可明显提高检测灵敏度，同时具有特异，快速，可靠的特点。

发明内容

本发明提供了一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、操作简单方便等特点。

本发明还提供了上述化学发光试剂盒的制备方法，适用工业化生产。

本发明的检测相思子毒素化学发光试剂盒，其特征在于：

以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液。以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成本发明的化学发光试剂盒。

本发明检测相思子毒素化学发光试剂盒的制备方法如下：

采用凝胶层析法从相思子中制备相思子毒素，用甲醛减毒处理制备类毒素，分别免疫家兔和Balb/C小鼠制备多克隆抗体和单克隆抗体。以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液。以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成本发明的化学发光试剂盒。

主要包括以下步骤：

(1)采用5％冷醋酸液抽提，并用35％～95％硫酸铵分级沉淀制备相思子毒素粗毒；再经Sepharose 6B亲和层析，DEAE-Sepharose FF离子交换层析以及Superdex 75凝胶过滤三步层析，制备相思子毒素；

(2)将从步骤(1)中制备得到的相思子毒素用1％甲醛减毒处理制备类毒素，用于免疫Balb/C小鼠制备单克隆抗体；

(3)采用Westerblot方法从步骤(2)中制备得到的单克隆抗体中筛选出特异性结合相思子毒素A链的单克隆抗体；

(4)用步骤(3)得到的单克隆抗体包被发光板，10％的羊血清封闭制备发光板；

(5)将步骤(2)中制备得到的相思子毒素类毒素免疫家兔制备兔源抗相思子毒素多克隆抗体；

(6)配制化学发光底物液、酶标抗体、稀释液、10倍浓缩洗涤液；

(7)将特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板；

(8)以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体；

(9)利用步骤(8)中包被好的化学发光板及步骤(9)中制备得到的酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液，以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成本发明的化学发光试剂盒。

本发明涉及的上述相思子毒素化学发光试剂盒，其中相思子毒素的制备方法：