[发明专利]基于蛋白质三聚化模序的高分泌性三聚体蛋白的表达方法有效

专利信息
申请号: 201010133096.0 申请日: 2010-03-12
公开(公告)号: CN101948864A 公开(公告)日: 2011-01-19
发明(设计)人: 凌虹;王甲业;李妍;陈文江;杨丹;程德春 申请(专利权)人: 哈尔滨医科大学
主分类号: C12N15/74 分类号: C12N15/74;C12N15/79
代理公司: 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 代理人: 孙皓晨;费碧华
地址: 150081 黑*** 国省代码: 黑龙江;23
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摘要:
搜索关键词: 基于 蛋白质 三聚 化模序 分泌 三聚体 蛋白 表达 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及一种外源蛋白的表达方法,尤其涉及一种高分泌性三聚体蛋白的表达方法,属于三聚体蛋白的表达领域。

背景技术

绝大多数分泌性蛋白质的氨基端都有一段15~35个氨基酸的信号肽(signalpeptide),其功能是引导新生的蛋白质多肽链穿过内质网膜进入内质网腔内。信号肽在穿越内质网膜后即被内质网腔内的信号肽酶水解切除,此时新生多肽链开始折叠及其他一系列修饰过程,再通过囊泡系统进入高尔基体完成进一步修饰,最终形成成熟的分泌蛋白。可见,对于分泌性蛋白而言,只有确保信号肽及时准确地切除,才能在细胞内生成足够量的活性蛋白,并最终获得理想的分泌产量(Li,Y.,et al.,Viral liposomes released from insect cells infected withrecombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus.J Virol,1993.67(7):p.4415-20.Kypr,J.and J.Mrazek,Unusual codon usage ofHIV.Nature,1987.327(6117):p.20.)。因此筛选具有相对实用性广和可高效率引导蛋白质分泌表达的信号肽序列是优化蛋白质外源表达的关键策略之一。基于信号肽可介导蛋白质分泌及可在不同蛋白质间互通使用的特点,可以通过优化信号肽序列或引入外源高分泌性信号肽来提高目的蛋白的产量和分泌效率。

人组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)的信号肽(Met-Asp-Ala-Met-Lys-Arg-Gly-Leu-Cys-Cys-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Gly-Ala-Val-Phe-Val-Ser-Pro-Ser)是目前应用最广泛的外源性信号肽之一。tPA信号肽具有强分泌信号肽的典型特征:1)信号肽N端有两个正电荷氨基酸,介导信号肽与内质网膜信号肽受体的识别;2)序列中部主要由疏水氨基酸组成疏水核心,具有形成α螺旋的倾向,有利于信号肽与脂质双层作用,引导新生肽穿过内质网膜;3)序列C末端靠近切割处主要由极性氨基酸组成,形成β折叠,容易断裂,符合信号肽酶的切割位点的特点。由于上述特征,tPA信号肽往往作为外源性信号肽应用于人体内或体外人类细胞系中目的蛋白的分泌表达。

Chapman等首次将tPA信号肽作为外源性分泌信号应用于HIV-1包膜糖蛋白(envelope glycoprotein,Env)的体外表达,其构建策略是删除目的蛋白的信号肽序列,将tPA信号肽引入目的蛋白的氨基端。用tPA信号肽替换Env原有信号肽后,Env蛋白分泌水平显著上升(Chapman,B.S.,et al.,Effect of intron A fromhuman cytomegalovirus(Towne)immediate-early gene on heterologous expressionin mammalian cells.Nucleic Acids Res,1991.19(14):p.3979-86.)。随后的研究进一步表明,tPA引导的Env蛋白的免疫原性明显强于野生株Env蛋白(Pfeiffer,T.,et al.,Effects of signal peptide exchange on HIV-1 glycoprotein expression and viralinfectivity in mammalian cells.FEBS Lett,2006.580(15):p.3775-8.)。截止目前,tPA信号肽也广泛用于结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、轮状病毒、日本脑炎病毒、痘苗病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒等多种细菌、病毒的结构蛋白的分泌表达,均不同程度地提高了目的蛋白的表达量和免疫原性。

2003年,中国国家知识产权局公开了四个SARS冠状病毒结构蛋白的表达质粒pVPH(CN1449827)、pVPM(CN1449828)、pVPS(CN1449829)、pVPS2(CN1449831)。其构建策略是将tPA信号序列插入SARS病毒M基因、HE基因、S基因或S蛋白抗原决定簇基因的N末端,再将融合基因克隆至原核或真核表达载体,作为SARS病毒的DNA疫苗候选。

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