[发明专利]一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法

权利要求书

1. 一种循环利用重组大肠杆菌AFP111细胞发酵生产丁二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸：先有氧培养快速提高菌体密度，继而转厌氧发酵产丁二酸；具体地：首先用LB培养基活化菌体，按体积比1%接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养菌体12 h左右作为种子液；按接种量3%转接JSM发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为25 g·L^-1，有氧培养至细胞干重在10～12 g·L^-1，培养过程溶氧维持在40%以上；改通CO₂气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50 g·L^-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8；

其中，所述的JSM发酵培养基是：葡萄糖40 g·L^-1；柠檬酸3 g·L^-1；Na₂HPO₄·7H₂O 3 g·L^-1；KH₂PO₄ 8 g·L^-1；(NH₄)₂HPO₄ 8 g·L^-1；NH₄Cl 0.2 g·L^-1；(NH₄)₂SO₄ 0.75 g·L^-1；MgSO₄·7H₂O 1.00 g·L^-1；CaCl₂·2H₂O 10.0 mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O 0.5 mg·L^-1；CuCl₂·2H₂O 0.25 mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 2.5 mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O 1.75 mg·L^-1；H₃BO₃ 0.12 mg；Al₂(SO₄)₃·xH₂O 1.77 mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O 0.5 mg·L^-1；柠檬酸铁 16.1 mg·L^-1；VB₁ 20·mg L^-1；生物素 2 mg·L^-1；

（2）利用两阶段发酵产生的中间代谢产物有氧诱导细胞内关键酶活：两阶段发酵结束时，培养基中无残糖，碳源仅剩中间代谢产物，此时发酵培养基改通空气或者氧气，并维持>40%的溶氧，以中间代谢产物为碳源，培养>2 h，诱导细胞内生产丁二酸过程中的关键酶酶活；

（3）无菌收集菌体细胞，在新鲜培养基中厌氧生物转化合成丁二酸；

（4）在步骤（3）结束时继续有氧诱导并转新鲜培养基生物转化合成丁二酸，达到细胞重复循环利用的目的：待步骤（3）中细胞葡萄糖的消耗速率下降至0.1 g·L^-1·h^-1，终止厌氧发酵并转有氧诱导细胞，继而实施步骤（3）。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（2）中的诱导细胞内关键酶活的酶是磷酸烯醇式丙酮酸激酶、异柠檬酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、富马酸酶、富马酸还原酶、丙酮酸脱氢酶中的一种或者多种。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（3）的具体方法为：收集已有氧诱导的细胞菌液，离心或者膜过滤获得细胞，并在新鲜培养基中进行厌氧发酵。