[发明专利]一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二 酸的方法，具体涉及利用两阶段发酵时产生的代谢产物有氧诱导提高重组大肠杆菌细胞 胞内酶活，并循环利用已提高胞内酶活的细胞生产丁二酸的方法。

背景技术

丁二酸(succinic acid)被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料 等行业，同时作为优秀的C4平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯 等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是 未来12种最有价值的生物炼制产品之一。

丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可 再生资源(葡萄糖、木糖等)，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且 在发酵过程中可吸收固定CO₂，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的 新途径，近年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要包括naerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷 氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。利用野生菌株生产丁二酸，虽然获得了较高的产物浓度， 但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。 大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近 年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。

利用大肠杆菌生产丁二酸的发酵模式主要包括专一性厌氧发酵及两阶段发酵。专一 性厌氧发酵时，菌株生长缓慢，丁二酸终浓度和收率均较低。Vemuri等人利用大肠杆菌 AFP111(PYC)两阶段发酵，其厌氧阶段可完成1.1g·g^-1的丁二酸收率和1.3g·L^-1·h^-1的丁二酸生产强度(Applied Environmental Microbiology.2002，68，1715～1727)。但如果 考虑有氧阶段消耗的糖及花费的时间，收率和生产强度将下降。Andersson等人通过及 时回收厌氧发酵细胞并转化新鲜培养基继续厌氧丁二酸生产，解除了产物抑制，延长了 丁二酸的生产时间，在相同时间内较两阶段发酵，产物浓度提高了60％；但过程中菌体 密度、细胞比生产强度都不断下降(Bioprocess and Biosystems Engineering.2009，DOI 10.1007/s00449-009-0393-y)。因此，若能解决在两阶段发酵结束时通过有氧短时间诱导 细胞，并收集已提高胞内关键酶活的细胞进一步厌氧转化合成丁二酸，将可大幅度提高 细胞的比生产强度，同时可有效延长厌氧丁二酸的生产时间。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种能提高重组大肠杆菌胞内合成丁二酸途径 关键酶酶活的方法，并利用已提高胞内酶活的微生物进一步转化合成丁二酸，以大幅度 提高菌株生产丁二酸整个过程的收率及生产强度。

为实现本发明循环利用重组大肠杆菌细胞生产丁二酸的目的，本发明采用以下技术 方案：

一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：

(1)利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；

所述的两阶段发酵，其特征在于先有氧培养菌体，继而转厌氧发酵产丁二酸：首先 用LB培养基活化菌体，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养菌体12 h左右作为种子液；按接种量3％转接JSM发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为25 g·L^-1，有氧培养至细胞干重在10～12g·L^-1，培养过程溶氧维持在40％以上；改通CO₂气体，进行厌氧发酵产酸，并分批补加葡萄糖，且最高浓度不超过50g·L^-1，同时添加 碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8。

(2)利用两阶段发酵产生的中间代谢产物有氧诱导细胞内关键酶活；

两阶段发酵结束时，培养基中无残糖，碳源仅剩丁二酸、乙酸、丙酮酸等中间代谢 产物，此时发酵培养基改通空气或者氧气，并维持＞40％的溶氧，以中间代谢产物为碳 源，培养＞2h，诱导细胞内生产丁二酸过程中的关键酶酶活。