[发明专利]一种用枯草芽孢杆菌提取的活性成分及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用枯草芽孢杆菌提取的活性成分及其应用，属于微生物农药领域。

背景技术：

随着越来越多的有毒化学农药逐渐被限制使用，生物农药由于具有生产原料来源广泛，对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，已成为全球农药产业发展的新趋势。很多真菌的属或菌种被用于来防治病虫害：如Trichoderma属，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，Pythium oligandrum，Verticillium chlamydosporium等。在利用真菌开发生物农药中，产生厚垣孢子是非常重要的，因为其含有丰富的内源营养，抗逆性大大高于分生孢子和菌丝体，可以克服分生孢子制剂存活期短，商品货架期短，而且可在土壤中定殖而不需要添加外源营养，从而提高防效。

真菌的不同种，其形成厚垣孢子的环境条件通常是有差异的，很多因素如营养、渗透压、光、pH值、温度、空气、细菌、药物处理和植物的刺激等都能诱导真菌形成厚垣孢子。Venkat Ram首先证明了从土壤中分离的细菌能诱导F.solani形成厚垣孢子，并认为是细菌产生的代谢物诱导的。但到目前为止，只有李蕾等报道枯草芽孢杆菌中的能诱导木霉形成厚垣孢子的化合物可能与抗真菌环肽物质IturinA很相似，而我们报道的能诱导真菌形成厚垣孢子的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis C2)的代谢物与IturinA不同，IturinA是环肽，茚三酮不显色，而此物质则显色，此物质能高效快速地诱导很多种真菌形成大量的厚垣孢子。参考文献：

[1]Venkat Ram，C.S.，1952.Soil bacteria and chlamydospore formation in Fusariumsolani.Nature 22：4334

[2]Li L.，Qu Q.，Tian B.Y.，Zhang K.Q.，2005.Induction of Chlamydospores in Trichodermaharzianum and Gliocladium roseum by Antifungal Compounds Produced by Bacillus subtilis C2.Journal of Phytopahtology 153：686-693

发明内容：

本发明的目的在于提供一种能诱导真菌形成厚垣孢子的用枯草芽孢杆菌代谢物提取的活性成分，为开发生物农药制剂奠定基础。

本发明的枯草芽孢杆菌代谢物中提取的活性成分，经如下步骤得到：

a.生产菌株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis C2)，该菌株已于2010年1月20日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：中国.北京.中关村；保藏号：CGMCC No：3586；

b.将B.subtilis C2的菌种接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养4天，获得试管种，固体培养基的配方：蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH 7.2；

c.将试管种接种到每瓶装100-300ml液体培养基的三角瓶中，在温度25-40℃、转速为150-250rpm下摇床培养2-5天；液体培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml；

d.将含有菌体的发酵液在45℃下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45℃下减压浓缩至干，得粗浸膏；

e.将粗浸膏在硅胶H柱上，先用体积比为1-4∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部分在45℃下减压浓缩得A馏分；

f.将A馏分用C18填料分离，依次用50-70％和100％的甲醇∶水洗脱，将100％洗脱下来的部分合并，在45℃下减压浓缩得B馏分；

g.将B馏分用SephadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml，将11-16瓶合并，得到枯草芽孢杆菌的活性成分C。