[发明专利]BRAF基因突变的快速检测

权利要求书

1.一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续核苷酸序列为SEQ ID No：3～20序列之一的正向或反向核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物为SEQ ID No：3～20序列之一的正向引物或反向引物。

4.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液              终浓度1～10×；

dNTPs                  0.1～0.5mM；

引物序列               终浓度为0.1～0.5μM；

模板DNA                0.1～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶           0.01～0.10U/μL；

MgCl₂                  终浓度为1～3mM；

荧光染料               1～3×。

5.根据权利要求4所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液              终浓度1～5×；

dNTPs                  0.2～0.3mM；

引物序列               终浓度为0.2～0.3M；

模板DNA                0.5～1.0ng/μL；

TaqDNA聚合酶           0.03～0.06U/μL；

MgCl₂                  终浓度为2～3mM；

荧光染料               1～2×。

6.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LCPLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

7.一种检测BRAF基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取包括含有BRAF基因的第十一外显子BRAF11或第十五外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；

(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRAF基因进行PCR扩增；

(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点(BRAF11和BRAF15)检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片中提取，进行PCR反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，40～50个循环。