[发明专利]BRAF基因突变的快速检测

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种BRAF基因突变的高灵敏快速检测。

背景技术

BRAF基因属于RAF家族成员，位于染色体7q34，大小为190Kb，含有七个转录区，包括18个外显子，编码一个67KD-99KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞的增殖、分化和凋亡。BRAF基因可在甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中发生突变。2002年Davie等在66％的恶性黑色素瘤和一系列的其它肿瘤中检测到BRAF基因体细胞突变，该突变主要见于BRAF基因11和15外显子的激酶结构域内，80％以上的突变都是15外显子1799位核苷酸上的单碱基颠换，致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。之后，不同国家和地域的学者在甲状腺乳头状癌(papillarythyroid cancer，PTC)中检测到了BRAF^v6ooE突变。由于该突变中在599位的苏氨酸活化性磷酸化位点附近插入了一个负性调节残基，可模拟活化区域的磷酸化过程，使BRAF基因与维持其失活态的ATP结合环活化区的联系中断，从而级联式激活，并通过RAS-RAF-MEK-MAPK激酶信号传导通路而引起细胞的异常增殖和分化，最终导致肿瘤的形成。

B-Raf基因突变被发现存在于黑色素瘤、大肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤中。本检测试剂盒用于辅助临床医生筛选出病患B-Raf基因突变情况。为临床医生用药提供指导和依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。

检测BRAF基因突变，对判断肿瘤的发生和发展后以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义。(1)正常人血检中出现BRAF基因异常，提示存在肿瘤易感性；(2)大量研究表明，无BRAF基因突变的结直肠癌等肿瘤患者，经帕尼单抗和爱比妥靶向药物治疗疗效明显，因此，通过检测BRAF基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。

恶性肿瘤病人血浆或血清中存在高水平的循环DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细胞。新近研究已经从癌症患者血浆或血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变，表明这是检测肿瘤相关基因改变的一条新途径。由于取材方便，血浆分子检测迅速成为肿瘤研究的一个热点。目前，血浆突变检测可以作为肿瘤分子诊断的一种新方法。

由于BRAF基因的突变对如甲状腺乳头状癌等肿瘤的相关性，所以检测BRAF的突变基因对及早诊断和治疗癌症有很大的临床意义。本发明主要是利用高分辨率溶解曲线分析来进行BRAF基因突变的高灵敏快速检测。

本试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRAF突变，协助临床医生实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。

目前普遍应用的BRAF基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序：该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法不适用于临床要求。

临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免污染的BRAF基因突变检测技术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性和高灵敏度的要求。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便和有效避免污染的检测BRAF基因突变的试剂盒，解决了现有技术中进行BRAF基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、精确度低和污染等问题，尤其提供了除组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测

本发明提供的技术方案是：

一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列。

优选的，所述连续核苷酸序列所述连续核苷酸序列为SEQ ID No：3～20序列之一的正向或反向核苷酸序列。

优选的，所述引物为SEQ ID No：3～20序列之一的正向引物或反向引物。