[发明专利]用于测定高半胱氨酸的方法

说明书

本申请是申请日为2004年7月9日、题为“用于测定高半胱氨酸的方法和组合物”的中国专利申请No.200480026009.4的分案申请。相关申请的交叉引用

本申请要求在2003年7月10日提交的临时申请U.S.顺序号60/486,865和在2004年3月15日提交的U.S.申请顺序号10/801,623的优先权利益，它们的内容通过参考完整地结合于此。

技术领域

本发明一般涉及高半胱氨酸检测领域。特别是，本发明提供一种测定样品中高半胱氨酸(Hcy)的存在或浓度的方法，其中在通过Hcy转化酶催化的Hcy转化反应中将高半胱氨酸与Hcy共底物反应以形成Hcy转化产物和Hcy共底物转化产物，和评估Hcy共底物转化产物以确定样品中Hcy的存在和/或浓度。本发明还提供了基于相同原理测定高半胱氨酸的试剂盒。

发明背景

体液如血浆或血清中的高半胱氨酸的总浓度是疾病的重要标志。例如，高半胱氨酸定量可以是心血管病重要的风险指标，可以是钴胺素和叶酸缺乏的灵敏标志，并且可以用于诊断称为高胱氨酸尿症的代谢的先天缺陷。高半胱氨酸定量也已经报道有效用于评估孕妇中的出生缺陷和老年人的认知损伤。参见Frantzen，等，Enzyme Conversion Immunoassay forDetermining Total Homocysteine in Plasma or Serum，Clinical Chemistry 44：2，311-316(1998)。

高半胱氨酸(Hcy)是在S-腺苷甲硫氨酸-依赖性甲基转移反应过程中由甲硫氨酸形成的含硫醇的氨基酸。胞内Hcy被再甲基化为甲硫氨酸，或者在一系列反应中不可逆地代谢形成半胱氨酸。胞内Hcy被输出到胞外流体如血液和尿中，并且大多以氧化的形式循环，主要与血浆蛋白质结合(Refsum，等，Annu.Rev.Medicine，49：31-62(1998))。血浆和尿中的Hcy的数量反映了Hcy生产和利用之间的平衡。该平衡可被各种临床状态所扰乱，所述临床状态其特征在于参与Hcy转硫作用和再甲基化的酶(例如，胱硫醚β-合酶和N^5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶)的遗传病或参与Hcy代谢的维生素类(例如维生素B₆，B₁₂和叶酸)的饮食缺乏(Baual，等，ClevelandClinic Journal of Medicine，64：543-549(1997))。另外，血浆Hcy水平还可能被一些用于治疗癌症或关节炎的药物如抗叶酸药物(例如甲氨蝶呤)所扰乱(Foody，等，Clinician Reviews，8：203-210(1998))。

一些高半胱氨酸血症病例是由编码参与Hcy代谢的酶的基因的纯合缺陷所导致。在这些病例中，参与Hcy再甲基化或转硫作用的酶的缺陷导致血液和尿中Hcy高达50倍的升高。这种病症的典型形式，先天性高半胱氨酸血症(Hcyemia)，是由编码胱硫醚β-合酶(CBS)的基因的纯合缺陷所导致。这些个体在早年患有血栓栓塞并发症，其导致中风，心肌梗死，肾血管性高血压，间歇性跛行，肠系膜局部缺血，和肺栓塞。这些患者还可能显示智力迟钝和其它类似于晶状体异位和骨骼畸形的异常(Perry T.，Homocysteine：Selected aspects in Nyham W.L.ed.Heritable disorders ofamino acid metabolism.New York，John Wiley & Sons，pp.419-451(1974))。还已知孕妇中升高的Hcy水平与具有神经管闭合的儿童出生缺陷有关(Scott，等，″The etiology of neural tube defects″in Graham，I.，Refsum，H.，Rosenberg，I.H.，and Ureland P.M.ed.″Homocysteine metabolism：from basicscience to clinical medicine″Kluwer Academic Publishers，Boston，pp.133-136(1995))。因此，Hcy测定的诊断应用已经在这些临床病症中很好地证明。