[发明专利]一种大规模生产动物用狂犬病毒抗原的方法

权利要求书

1.一种狂犬病毒抗原的制备方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统大规模生产狂犬病毒抗原，包括如下技术步骤：

(1)培养制备抗原用细胞

将可增殖狂犬病毒的细胞系接种到含有培养液与微载体的载体罐中，并将上述细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；切换细胞培养程序，在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍；

(2)毒液的接种与繁殖

将狂犬病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；换用细胞维持培养液，在适当培养环境下培养病毒；连续培养3～5日后，第一次收获病毒液，采用半连续工艺，换液比例为50％；继续培养9～11日，每24h收获换液一次，换液比例为50％；

(3)经检验合格后，将半连续工艺收获的病毒液与生物反应器的病毒液混合，于-20℃冻融两次，灭活纯化得到狂犬病毒抗原。

2.根据权利要求1所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于，所述细胞微载体悬浮培养系统为潮汐式。

3.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于步骤(1)中启动贴附程序4h后切换培养程序；所述的细胞贴附程序参数为：up：2200～2600mL/min hold 40～100s、Down：2200～2600mL/min hold 40～75s、设定最大换液量18500mL；细胞培养程序参数为：up：1600～2000mL/min hold40～100s、Down 1600～2000mL/min hold 40～100s、设定最大换液量18500mL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中启动吸附程序后4h换成病毒培养程序，所述病毒吸附程序参数为：up：1300～1700mL/min hold40～100s、Down：1300～1700mL/min hold 40～75s、设定最大换液量18500mL；病毒培养程序参数为：up：1000～1400mL/min hold 40～100s、Down1000～1400mL/min hold 40～100s、设定最大换液量18500mL。

5.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于所述可增殖狂犬病毒的细胞系为仓鼠肾细胞系；培养液为95％～98％DMEM，加2％～5％牛血清，加适量抗菌素，pH值为7.0～7.4；所述微载体为聚酯纤维。

6.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于细胞培养温度36～37℃，培养环境中含有2.5％～5％二氧化碳。

7.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体，细胞初始接种量为1.8～3.6×10⁷cells/g微载体。

8.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的接种狂犬病毒时的细胞密度为1.1×10⁸～1.0×10⁹cells/g微载体。

9.根据权利要求2所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2)按病毒感染复数(M.O.I.)为0.01～1的比例接种病毒。